魯盛靜,田野

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所，北京 100097；2.北京聯(lián)合智業(yè)質(zhì)量檢驗(yàn)有限公司，北京 100101)

引 言

根據(jù)國(guó)內(nèi)外目前的相關(guān)資料，目前測(cè)定維生素B12主要有4種方法：比色法、原子吸收分光光度法、高效液相色譜法及微生物法。其中微生物法是通用方法，該法靈敏度很高，但由于該法操作關(guān)鍵點(diǎn)多，微生物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，成本高等問(wèn)題而不能廣泛應(yīng)用。但對(duì)于含量低，且低于儀器檢出限的維生素仍然需要微生物法進(jìn)行測(cè)定，公職分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)和美國(guó)藥典(USP)以及中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5413.14—2010都將微生物法作為維生索Bb測(cè)定的主要方法和仲裁方法，儀器法作為輔助方法。微生物法的高靈敏度和可靠性已得到國(guó)際權(quán)威機(jī)構(gòu)的認(rèn)可。所以推廣微生物法很有意義。

1 維生素B12特性及功能

維生素B12是人體內(nèi)每天需要量最少的一種，過(guò)量的維生素B12會(huì)產(chǎn)生毒副作用。據(jù)報(bào)道注射過(guò)量的維生素B12可出現(xiàn)哮喘、蕁麻疹、濕疹、面部浮腫、寒顫等過(guò)敏反應(yīng)，也可能相發(fā)神經(jīng)興奮、心前區(qū)痛和心悸。維生素B12攝入過(guò)多還可導(dǎo)到葉酸的缺乏［1］。尤其對(duì)嬰幼兒奶粉的控制量更為重要，在國(guó)標(biāo)GB 10765-2010中明確規(guī)定一段奶粉維生素B12標(biāo)準(zhǔn)量為0.025～0.360 μg/100 kJ,較大嬰兒配方奶粉維生素B12量為≥0.04 μg/100 kJ［2］。

表1 維生素B12需求量［3］

2 微生物法與高效液相色譜法比較

根據(jù)國(guó)內(nèi)目前的相關(guān)資料，測(cè)定維生素B12主要有微生物法［4］和高效液相色譜法［5］。 高效液相色譜法大都用于保健食品、藥品及維生素預(yù)混料等樣品，該類樣品一般維生素B12質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高或基質(zhì)簡(jiǎn)單，易于檢測(cè)。

目前有關(guān)液相色譜法測(cè)定維生素B12方法中檢出限一般都不能滿足奶粉專用維生素添加劑的測(cè)定。如國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的方法［6］，測(cè)定液中要求在10 μg/mL以上；測(cè)定飼料添加劑時(shí),測(cè)定液中要求在40 μg/mL左右。而奶粉專用復(fù)合維生素添加劑中的維生素B12質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般為10 μg/g或更低(國(guó)標(biāo)規(guī)定嬰幼兒配方奶粉中維生素B12質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥0.8 μg/100 g,即維生素添加劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般應(yīng)在800 μg/100 g 以上)［7］，若稱取樣品量為10 g左右 (稱樣量過(guò)大樣品無(wú)法完全溶解及會(huì)影響色譜柱分離)，定容至50 mL時(shí)，測(cè)定液中維生素B12含量約為2 μg/mL；且許多樣品中的維生素B12質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于10 μg/g,制備液甚至在1 μg/mL以下，所以用于測(cè)定此類樣品中維生素B12質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法必須達(dá)到一定的檢出限。另外在奶粉專用復(fù)合維生素添加劑中除含有10多種維生素外,還有其他雜質(zhì)。這些組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)高于維生素B12質(zhì)量分?jǐn)?shù),要通過(guò)色譜柱進(jìn)行有效分離并準(zhǔn)確定量測(cè)定，在選擇合適的色譜柱的同時(shí),還需研究相應(yīng)的測(cè)定條件及樣品處理方法。因此，液相色譜法測(cè)定維生素B12有較明顯的局限性，對(duì)于乳制品中維生素B12的測(cè)定更為困難。

微生物法是測(cè)定如食品中維生素B12的通用方法，微生物是生長(zhǎng)旺盛，繼代時(shí)間短，比表面積很大的生命體。微生物對(duì)環(huán)境的高度依賴性決定了微生物法的高度靈敏性?？蓽y(cè)定出樣液中0.01 ng/mL的質(zhì)量濃度。若認(rèn)定一臺(tái)儀器，固定其工作狀態(tài)和測(cè)定條件，則該方法可消除因儀器而產(chǎn)生的一些誤差。

綜上分析，高效液相色譜HPLC測(cè)定的是跟維生素標(biāo)準(zhǔn)品具有相同化學(xué)結(jié)構(gòu)的維生素，跟生物活性沒(méi)有直接關(guān)系，導(dǎo)致：①?zèng)]有生物活性的維生素被檢測(cè)；②具有生物活性但化學(xué)機(jī)構(gòu)與標(biāo)準(zhǔn)品不同的維生素漏測(cè)，只有具有生活活性的維生素才能被人或者動(dòng)物吸收利用。微生物法利用微生物對(duì)于某種維生素的特異性和靈敏性，測(cè)定的正是具有生物活性的一部分維生素。

3 實(shí)驗(yàn)原理

利用萊士曼氏乳酸桿菌(Lactobacillus leichmannii)對(duì)維生素B12的特異性和靈敏性，定量測(cè)定出試樣中維生素B12的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在測(cè)定用培養(yǎng)基中供給除維生素B12以外的所有營(yíng)養(yǎng)成分，這樣微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生的透光率就會(huì)同標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液及未知待測(cè)溶液中維生素B12的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)應(yīng)。以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的透光率相對(duì)于各濃度水平標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出試樣中維生素B12的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

4 實(shí) 驗(yàn)

4.1 儀器

具體參見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)GB5413.14—2010。試管和移液管處理：由于堿性的洗滌劑會(huì)對(duì)萊士曼氏乳酸桿菌的生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用，所以如果洗刷不干凈的試管會(huì)讓菌種長(zhǎng)的過(guò)于旺盛，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)不成梯度，實(shí)驗(yàn)失敗。試管內(nèi)的油漬也會(huì)促進(jìn)菌種的生長(zhǎng)，所以所用到的玻璃器皿的清洗尤為重要，是實(shí)驗(yàn)成敗的重要因素之一，也是很多實(shí)驗(yàn)室最容易犯的錯(cuò)誤之一，建議單獨(dú)使用固定試管。正確做法是硬玻璃測(cè)定管用洗滌劑進(jìn)行清洗，，或用20%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸浸泡處理，再用蒸餾水多次沖洗，再在200℃干熱2～3 h。其他必要的玻璃器皿可以用洗液直接清洗，沖洗干凈待用。介紹一種強(qiáng)酸氧化劑洗液:強(qiáng)酸氧化劑洗液是用重鉻酸甲(K2CrO7)和濃硫酸(H2SO4)配成。K2Cr2O7在酸性溶液中，有很強(qiáng)的氧化能力，對(duì)玻璃儀器又及少有侵蝕作用。所以這種洗液在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用最廣泛[8]。

4.2 試劑

維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品：分子式C63H88CoN14O14P，純度為99.8%，計(jì)算濃度時(shí)純度參與計(jì)算。

培養(yǎng)基：乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基，乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，維生素B12測(cè)定用培養(yǎng)基。

5 菌種復(fù)活與傳代

根據(jù)萊士曼氏乳酸桿菌(Lactobacillusleichmannii)ATCC7830的特點(diǎn)，該菌種生命力不強(qiáng)，在維生素B12斜面上存活時(shí)間比較短，需要定期傳代、作為工作菌種的一般儲(chǔ)存狀態(tài)。為了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定性和重復(fù)性好，菌種最好只使用2～5代，防止代數(shù)過(guò)多菌種變異或者污染導(dǎo)致特性減弱或引入雜菌影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，菌種活力直接影響實(shí)驗(yàn)成敗，要提出特別注意。菌種在斜面一般5～7 d就需要傳一代。維生素B12肉湯用于實(shí)驗(yàn)前一天的增菌，不適宜用于菌種保藏。短期保藏可以用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%甘油肉湯儲(chǔ)藏，冷凍干燥(脫脂乳洗脫冷凍干燥)保藏可以用于菌種的長(zhǎng)期儲(chǔ)藏。也可以用成品的菌種保藏管長(zhǎng)期保存［9］。表 2為不同培養(yǎng)基特點(diǎn)及用途。

表2 不同培養(yǎng)基特點(diǎn)及用途

6 標(biāo)準(zhǔn)液的制備

具體參見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)GB5413.14—2010。

在做稀釋時(shí)候可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室具體情況另作調(diào)整，比如可以吸取2 mL到100 mL和200 mL容量瓶中，同樣制備成高濃度溶液的質(zhì)量濃度為0.02 ng/mL；低質(zhì)量濃度溶液的質(zhì)量濃度為0.01 ng/mL。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液要儲(chǔ)存于冰箱內(nèi),中間工作液保存期3個(gè)月，工作液臨用前配制。

7 樣品處理

稱一定量的樣品(含維生素B12約50～100 ng，一般奶粉樣品按最低限稱取，因?yàn)橐话愫科?，固體樣品要注意粉樣均勻，液體吸取時(shí)要用大肚移液管吸取，大肚移液管要清洗干凈不能掛壁，移取樣品時(shí)擦干大肚移液管外壁液體，防止取樣不精確。稱取時(shí)不能超過(guò)25 g最大稱取量，防止水解釋放不完全。加入10 mL緩沖溶液時(shí)要充分混勻之后再加入150 mL蒸餾水。內(nèi)源性(天然)的維生素是和蛋白質(zhì)結(jié)合存在的。必須經(jīng)熱或酶分解成游離態(tài)才能被測(cè)定，提取目的就是釋放出維生素。幫助樣品中維生素B12水解時(shí)很好釋放。冷卻后調(diào)pH值至4.5±0.2，使得樣品中蛋白質(zhì)沉淀，確保溶液澄清，溶液的渾濁對(duì)測(cè)吸光度影響很大，如果被測(cè)樣品無(wú)法澄清就做無(wú)菌空白試樣(只加培養(yǎng)基不加菌)，計(jì)算時(shí)減本底吸光度值。再用水定容至250 mL，過(guò)濾。移取濾液5 mL，加入水20～30 mL，調(diào)pH至6.8±0.2，此處調(diào)節(jié)pH值是保證維生素B12和萊士曼氏乳酸桿菌在pH中性中培養(yǎng)，用水定容至100 mL。最終溶液中維生素B12的質(zhì)量濃度約在0.01～0.02 ng/mL。

水解后的樣品可以在冰箱內(nèi)儲(chǔ)藏3 d左右，稀釋后的樣品不可以儲(chǔ)藏用于下次實(shí)驗(yàn)。表3為標(biāo)準(zhǔn)系列試管編號(hào)及加樣量；表4為樣品試管編號(hào)及加樣量。

表3 標(biāo)準(zhǔn)系列試管編號(hào)及加樣量

表4 樣品試管編號(hào)及加樣量 mL

8 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

8.1 滅菌

系列和樣品的所有的試管蓋上試管帽，121℃滅菌5 min(商品培養(yǎng)基按標(biāo)簽說(shuō)明進(jìn)行滅菌)?？蓪⑿枰木S生素B12測(cè)定用培養(yǎng)基根據(jù)需要一同滅菌。滅菌時(shí)要保持試管間適當(dāng)?shù)拈g隙，維持空氣流通，盡量保證實(shí)驗(yàn)條件一致。

8.2 菌懸液制備

將培養(yǎng)好的菌懸液置于離心機(jī)中離心，去上清液加入10 mL滅菌高純水混勻反復(fù)離心3～4次再加入10 mL滅菌高純水待用。

8.3 接種

將上述試管迅速冷卻至30℃以下，培養(yǎng)基冷卻至45℃左右，加菌量的控制很重要，決定了實(shí)驗(yàn)的成敗，萊士曼氏乳酸桿菌從維生素B12斜面接到維生素B12肉湯后培養(yǎng)時(shí)間不適宜過(guò)長(zhǎng)，一般過(guò)夜后第二天早上觀察菌量及時(shí)停止培養(yǎng)，以免菌種大量生長(zhǎng)，造成老化，影響實(shí)驗(yàn)比色結(jié)果。用滅菌的高純水洗脫菌3～4次，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)試透光率，以生理鹽水做空白，透光率一般在60%～80%為宜，75%的透光率500 mL的培養(yǎng)基加菌0.5 mL，混勻培養(yǎng)基，用滅菌滴管向上述試管中各滴加5 mL培養(yǎng)基 (其中標(biāo)準(zhǔn)曲線管中空白1除外)，加菌也可以用移液槍加菌懸液。加菌量的控制和重要，如果菌量加多了培養(yǎng)24 h后系列和樣品生長(zhǎng)濁度過(guò)高而導(dǎo)致不成梯度，無(wú)法比色而實(shí)驗(yàn)失敗，或者導(dǎo)致不加菌空白渾濁，即使系列線性很好的情況下，也會(huì)使實(shí)驗(yàn)數(shù)值便高。如果加菌量少了，培養(yǎng)24 h后系列和樣品生長(zhǎng)濁度過(guò)低而需要繼續(xù)培養(yǎng)，延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

8.4 培養(yǎng)

將加完菌的試管用渦旋混合器混勻，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，36℃ ±1℃培養(yǎng)19～20 h，培養(yǎng)時(shí)要保持試管間適當(dāng)?shù)拈g隙，維持空氣流通，盡量保證實(shí)驗(yàn)條件一致。能用搖床式培養(yǎng)更好，混勻幫助生長(zhǎng)。20 h左右要隨時(shí)觀看比色濁度，再用渦旋混合器混勻幫助生長(zhǎng)，隨時(shí)準(zhǔn)備比色。

8.5 比色

最佳比色時(shí)間是系列最高濃度的透光率在30%左右，確保2 h之內(nèi)透光率變化小于2%即可讀取數(shù)據(jù)，可以確保透光率拉開(kāi)梯度，太低的透光率使系列拉不開(kāi)導(dǎo)致斜率低。如果把握不好比色終點(diǎn)可多做幾根系列高濃度點(diǎn)，培養(yǎng)18 h后每隔一個(gè)小時(shí)比色一次判斷比色終點(diǎn)，當(dāng)透光率梯度不明顯時(shí)可用吸光度值測(cè)定結(jié)果。

8.6 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)樣品的透光率由計(jì)算公式求出相應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每支試管測(cè)得的濃度不得超過(guò)該平均值的±15%，超過(guò)者要舍去。符合該要求的管數(shù)少于所有的4個(gè)編號(hào)的待測(cè)液的總管數(shù)的2/3，用于計(jì)算試樣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)是不充分的,需要重新檢驗(yàn)。兩次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不得超過(guò)平均值的±10%。

9 結(jié)果與討論

9.1 標(biāo)準(zhǔn)系列

建議做3個(gè)平行，在取舍的時(shí)候選擇性和對(duì)比性更好，系列是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素，長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)證明，同樣的樣品反復(fù)多次實(shí)驗(yàn)，樣品透光率基本不會(huì)有大變動(dòng)，變化的是系列本身，從而導(dǎo)致結(jié)果變化。樣品第一次做可以做兩個(gè)平行，找到合適的稱取量范圍之后再做3個(gè)平行來(lái)分析出數(shù)，這樣在保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)精準(zhǔn)的前提下可以減少實(shí)驗(yàn)成本。

9.2 回收率

吸取102 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液1 mL作為質(zhì)控樣和樣品做同樣前處理、水解、稀釋、加樣、加菌、培養(yǎng)、比色，一般回收率在95%左右。標(biāo)準(zhǔn)系列讀數(shù)(略)。

由質(zhì)控樣讀數(shù)結(jié)果(略)，經(jīng)計(jì)算指控樣質(zhì)量濃度為100 ng/mL， 指控樣回收率為98%。

9.3 線性關(guān)系

以吸光度與質(zhì)量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=-711.2x+94.65,R=0.9944。結(jié)果表明，維生素B12對(duì)照品溶液在0.01～0.10 ng范圍內(nèi)質(zhì)量與吸收程度呈良好的線性關(guān)系。

9.4 精密度實(shí)驗(yàn)

精取質(zhì)量濃度為102 ng/mL的標(biāo)品溶液在540 nm連續(xù)測(cè)定5次，測(cè)得維生素B12的平均吸光度為81.56，65.98，49.50，41.06。 RSD 值 為 0.01% ，0.01% ，0.03%，0.02%(n=5)。 RSD數(shù)值較小，說(shuō)明該方法精密度好。

9.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精取同一質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品102 ng/mL，分別按標(biāo)準(zhǔn)稀釋方法制備一式5份的供試品溶液 (可稱之為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)控樣)，測(cè)定其質(zhì)量濃度，計(jì)算得維生素B12的平均質(zhì)量濃度為94.8 ng/mL，RSD值為0.07%(n=5)，說(shuō)明該方法有較好的重復(fù)性。

10 結(jié)束語(yǔ)

綜上所述，雖然微生物測(cè)定法不易掌握，但經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)歸納總結(jié)，實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵點(diǎn)控制，GB5413.14-2010方法精密度和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果良好，對(duì)于質(zhì)量分?jǐn)?shù)甚微的維生素測(cè)定、低于儀器最低檢出限的維生素測(cè)定、具有生物活性的維生素的檢測(cè)具有一定指導(dǎo)意義。

[1]李寧，黎海芪.維生素B12缺乏的研究進(jìn)展 [J].國(guó)際兒科學(xué)雜志2009，36(2)188-190.

[2]中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品[S].標(biāo)準(zhǔn)號(hào):GB10765-2010.

[3]中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì).中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2008.

[4]中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測(cè)定[S].標(biāo)準(zhǔn)號(hào):GB5413.14-2010.

[5]劉娜,陳大舟,湯樺,等.嬰兒配方奶粉中8種水溶性維生素的高效液相色譜同時(shí)測(cè)定[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2008,27(4):408-411.

[6]國(guó)家藥品監(jiān)督管理局.國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn).注射用多種維生素(9)[S].標(biāo)準(zhǔn)號(hào)WS1-XG-2002.

[7]中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).嬰幼兒配方食品及嬰幼兒補(bǔ)充谷粉通用技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[S].標(biāo)準(zhǔn)號(hào):GB10767-1997.

[8]夏玉宇，化學(xué)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)[M].2版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008.

[9]沈萍.微生物學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2001:19-20.