熊堯，謝英，張世湘，張列兵，羅云波，郝彥玲

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083)

0 引 言

細(xì)菌素是某些細(xì)菌在代謝過(guò)程中通過(guò)核糖體合成產(chǎn)生的一類(lèi)具有抑菌生物活性的蛋白質(zhì)或多肽[1]。乳酸菌細(xì)菌素可分為四大類(lèi)，其中IIa類(lèi)細(xì)菌素因其對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌有強(qiáng)烈的抑制作用，而成為天然防腐劑研究與開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)[2，3]。根據(jù)植物乳桿菌素LB-B1的理化性質(zhì)及基因簇結(jié)構(gòu)，確定其屬于IIa類(lèi)細(xì)菌素[4]。

大量研究表明：敏感菌株的甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(EIItMan)是IIa細(xì)菌素發(fā)揮抑菌作用的受體[5-6]。包括IIAB、IIC和IID三個(gè)組分，IIAB位于細(xì)胞質(zhì)，IIC和IID定位于細(xì)胞膜。利用異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明：組分IIAB不參與IIa類(lèi)細(xì)菌素的位點(diǎn)識(shí)別，組分IIC和組分IID是細(xì)菌素識(shí)別的靶點(diǎn)[7-10]。但異源表達(dá)存在的問(wèn)題是不能克服異源宿主本身IID組分的干擾。本研究利用同源重組的方法將敏感菌株IID組分突變，為是否IID組分在IIa細(xì)菌素位點(diǎn)識(shí)別中發(fā)揮作用提供直接證據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

(1)菌株及質(zhì)粒。植物乳桿菌LB-B1和植物乳桿菌WQ0815由本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌EC1000和質(zhì)粒pORI28由荷蘭格羅寧根大學(xué)Jan Kok教授惠贈(zèng)，輔助質(zhì)粒pTRK669由美國(guó)北卡羅來(lái)納州立大學(xué)Klaenhammer教授惠贈(zèng)。

(2)試劑。DNA Marker DL2000，T4-DNA連接酶,ExTaq DNA聚合酶，限制性?xún)?nèi)切酶，RNase A，卡那霉素，紅霉素和氯霉素，DNA回收試劑盒，其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

(1)利用PCR擴(kuò)增IID同源臂。根據(jù)植物乳桿菌ST-III(GenBank Acession No.CP002222.1)的IID序列，設(shè)計(jì)同源臂的引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，序列如下：

IID上游引物：5'-CGGGATCCATTGATGACG TTACG-3'

IID下游引物：5'-GCTCTAGACACATGCAGAG GAAGGTT-3'

在上游引物和下游引物的5'端分別加入BamH I和Xba I的酶切位點(diǎn)(下劃線)。以植物乳桿菌WQ0815的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94℃5 min；94 ℃(30s)，60 ℃ (30 s)，72 ℃(1 min)，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃(10 min)。PCR反應(yīng)后，進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)并進(jìn)行序列測(cè)定。

(2)同源重組質(zhì)粒pORI28-IID的構(gòu)建及鑒定。利用Xba I和BamH I酶切IID同源臂PCR產(chǎn)物和pORI28質(zhì)粒，用T4-DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌EC1000。轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布于同時(shí)含卡那霉素(50 μg/mL)和紅霉素(50 μg/mL)平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。利用PCR擴(kuò)增同源臂的方法來(lái)鑒定同源重組質(zhì)粒pORI28-IID是否構(gòu)建成功。

(3)植物乳桿菌WQ0815 IID組分突變株的構(gòu)建。將同源重組質(zhì)粒pORI28-IID電轉(zhuǎn)化入攜帶有輔助質(zhì)粒pTRK669的植物乳桿菌WQ0815的感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化后的植物乳桿菌涂布于同時(shí)含有紅霉素(5 mg/L)和氯霉素(20 mg/L)的平板上，將抗性菌落在高溫(42℃)和紅霉素(5 mg/L)雙重選擇壓力下連續(xù)傳代培養(yǎng)3次，使之發(fā)生進(jìn)行同源重組以構(gòu)建突變株，構(gòu)建策略如圖1所示。

(4)植物乳桿菌WQ0815 IID突變株的鑒定。如果成功發(fā)生同源重組，突變株的染色體上會(huì)插入紅霉素抗性基因序列。因此，根據(jù)紅霉素抗性基因(Em)設(shè)計(jì)上游引物，根據(jù)同源臂設(shè)計(jì)下游引物，利用PCR擴(kuò)增鑒定重組子，引物序列如下：

IID-Em上游引物：5'-TTTTAGCAAACCCGTA TTCCAC-3'

IID-Em下游引物：5'-GCTCTAGACACATGCA GAGGAAGGTT-3'

以疑似突變株的基因組DNA為模板，野生型菌株為對(duì)照。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72℃ 1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10 min。PCR反應(yīng)后，進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)并進(jìn)行測(cè)序。

(5)植物乳桿菌WQ0815突變株對(duì)植物乳桿菌素LB-B1敏感性檢測(cè)。將植物乳桿菌LB-B1在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h，發(fā)酵液在12 000×g下離心10 min，取上清液調(diào)pH至6.0以制備植物乳桿菌素LB-B1發(fā)酵上清液。采用牛津杯法，以野生株和突變株為指示菌，檢測(cè)突變前后植物乳桿菌WQ0815對(duì)植物乳桿菌素LB-B1敏感性的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增IID同源臂

以植物乳桿菌WQ0815基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由圖2可以看出，目的片段與預(yù)期片段大小一致，測(cè)序結(jié)果表明該片段大小為560 bp，經(jīng)NCBI/BLAS比對(duì)確定目的片段與植物乳桿菌ST-III中IID的同源性達(dá)到99%，說(shuō)明IID同源臂擴(kuò)增成功。

2.2 同源重組質(zhì)粒pORI28-IID的鑒定

通過(guò)抗生素篩選含有疑似同源重組質(zhì)粒的大腸桿菌EC1000轉(zhuǎn)化子，以疑似同源重組質(zhì)粒為模板，從圖3可見(jiàn)，擴(kuò)增得到的目的片段與預(yù)期大小一致，測(cè)序結(jié)果表明該目的片段為IID同源臂，說(shuō)明同源重組質(zhì)粒pORI28-IID構(gòu)建成功。

2.3 植物乳桿菌WQ0815 IID基因突變株的鑒定

以紅霉素抗性基因(Em)序列設(shè)計(jì)的上游引物和以同源臂序列設(shè)計(jì)下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定突變株。從圖4可見(jiàn)，以野生型菌株的基因組為模板沒(méi)有擴(kuò)增出條帶，而疑似突變株的基因組擴(kuò)增出與預(yù)期片段大小一致的目的條帶。目的片段測(cè)序后，利用DNAMAN軟件將目的片段與紅霉素抗性基因和IID序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明該目的片段包括紅霉素抗性基因和IID的部分序列，說(shuō)明植物乳桿菌WQ0815的IID突變體構(gòu)建成功。

2.4 對(duì)植物乳桿菌素LB-B1的敏感性檢測(cè)

采用牛津杯法，以植物乳桿菌WQ0815的野生株和突變株為指示菌。圖5為植物乳桿菌WQ0815的野生株與突變株對(duì)植物乳桿菌素LB-B1敏感性分析。由圖5可以看出，植物乳桿菌素LB-B1對(duì)植物乳桿菌WQ0815的野生株有抑制作用，而將IID基因突變后，抑菌圈消失，說(shuō)明突變株對(duì)植物乳桿菌素LB-B1產(chǎn)生抗性。

3 結(jié) 論

本研究根據(jù)同源重組原理，將對(duì)IIa類(lèi)細(xì)菌素敏感的植物乳桿菌WQ0815中甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)II(EIItMan)的IID基因進(jìn)行突變，突變株對(duì)IIa類(lèi)細(xì)菌素產(chǎn)生抗性，說(shuō)明IIa類(lèi)細(xì)菌素發(fā)揮抑菌作用時(shí)，敏感菌株中EIItMan中的IID組分發(fā)揮著受體分子識(shí)別和結(jié)合的作用，當(dāng)IID基因在突變菌株中不能正常表達(dá)時(shí)，IIa類(lèi)細(xì)菌素不能與細(xì)胞膜上的特定組分結(jié)合，從而失去了對(duì)植物乳桿菌WQ0815突變體的抑制作用。研究結(jié)果為確定IID組分在IIa細(xì)菌素位點(diǎn)識(shí)別中發(fā)揮的作用提供了直接證據(jù)。

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