馮愛(ài)青，胡秋孌，侯曉慧

（1.洛陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)系，河南 洛陽(yáng) 471022；2.洛陽(yáng)師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471022）

2006 年在上海召開(kāi)的“中國(guó)大豆食品產(chǎn)業(yè)圓桌峰會(huì)議”提出了發(fā)展中國(guó)大豆產(chǎn)業(yè)，實(shí)施“雙蛋白（大豆+牛奶）工程”振興計(jì)劃[1]，人們對(duì)大豆蛋白的研究與開(kāi)發(fā)倍加重視。大豆是最豐富、最優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，其水溶性蛋白質(zhì)可以被人體直接吸收利用，因此對(duì)大豆水溶性蛋白的研究及測(cè)定具有重要意義[2-3]。

國(guó)內(nèi)對(duì)大豆水溶性蛋白質(zhì)的測(cè)定主要采用經(jīng)典的凱氏定氮法，此法操作繁雜，而且測(cè)定的是樣品中的含氮量，除了蛋白質(zhì)組成中的氮外，還包括非蛋白質(zhì)組成中的其他有機(jī)或無(wú)機(jī)態(tài)氮[4-5]。如何科學(xué)準(zhǔn)確地測(cè)定蛋白質(zhì)含量，是現(xiàn)代食品檢測(cè)研究中最活躍的領(lǐng)域之一，也是解決食品安全方面所面臨的重要問(wèn)題。

蛋白質(zhì)測(cè)定的光譜分析方法有直接紫外光譜法、分光光度法、熒光光度法、共振瑞利散射光譜法等。其中分光光度法具有操作簡(jiǎn)便、成本低、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在pH2.90 的Britton-Robinson緩沖介質(zhì)中，紫紅色的有機(jī)試劑對(duì)乙?；嫉饶芘c蛋白質(zhì)形成藍(lán)色復(fù)合物，λmax 669 nm，該波長(zhǎng)下的表觀摩爾吸光系數(shù)為3.09×105L/（mol·cm），蛋白質(zhì)在10 μg/mL～100 μg/mL（BSA）范圍內(nèi)遵循比爾定律，以此建立的蛋白質(zhì)測(cè)定新方法，線性范圍寬，靈敏度高。用于大豆水溶性蛋白的測(cè)定，操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，基本無(wú)干擾，取得滿意結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-3010 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本日立公司；pHS-3C 精密pH 計(jì)：上海雷磁儀器廠；722 型光柵分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司；10 mL 具塞比色管。

對(duì)乙?；嫉龋荷虾ｉL(zhǎng)科試劑研究所，2.0×10-4mol/L；牛血清白蛋白、人血清白蛋白：BSA、HSA，北京百泰生化技術(shù)公司；卵蛋白（OVA）：上海伯奧生物科技公司；溶菌酶（LYS）：上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司；酪蛋白（CAS）：上海華碩精細(xì)化學(xué)品有限公司；蛋白質(zhì)濃度均為1 mg/mL；Britton--Robinson（B-R）緩沖溶液；十二烷基硫酸鈉（SDS），0.1%；TritonX-100（TX-100），1%；溴代十六烷基吡啶（CPB），0.1%；聚乙醇辛基苯基醚（OP），2%。所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為二次去離子水。

1.2 方法

于10 mL 具塞比色管中依次加入1.0 mLB-R 緩沖溶液，2.0 mL 對(duì)乙酰基偶氮羧溶液，0.5 mLBSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液，1.0 mLTX-100 溶液，水稀釋至刻度，搖勻，以相應(yīng)試劑為參比，用1 cm 比色皿掃描吸收光譜或于669 nm 測(cè)定溶液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收光譜

吸收光譜如圖1。

圖1 吸收光譜圖（pH2.90）Fig.1 Absorption spectra（pH2.90）

在pH2.90 的B-R 緩沖溶液中，對(duì)乙酰基偶氮羧的λmax 為577 nm（a），加入BSA 后，溶液顏色由透明紫紅色變?yōu)樗{(lán)色，在669 nm 處產(chǎn)生最大吸收（b），表明有新的物質(zhì)生成。從對(duì)乙酰基偶氮羧和BSA 在酸性條件下的結(jié)構(gòu)可知，二者主要靠靜電引力形成了復(fù)合物，使λmax 紅移約92 nm。在一定濃度范圍內(nèi)，BSA 濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系，實(shí)驗(yàn)選擇669 nm 作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 緩沖溶液及用量選擇

在不同pH 的緩沖溶液中，測(cè)定復(fù)合物的吸光度。結(jié)果表明：在VB-R=0.5 mL～2.0 mL 的緩沖溶液中，體系穩(wěn)定，吸光度值最大。實(shí)驗(yàn)用1.0 mL 的B-R 緩沖溶液，控制反應(yīng)體系的pH 為2.90。

2.3 試劑用量選擇

固定蛋白質(zhì)的用量，改變對(duì)乙?；嫉鹊挠昧浚S著對(duì)乙?；嫉扔昧康脑黾樱舛仍诓粩嗟脑黾?，VR=1.8 mL～2.2 mL 時(shí)吸光度基本保持不變，實(shí)驗(yàn)取對(duì)乙?；嫉鹊挠昧繛?.0 mL，CR/CBSA=54∶1。

2.4 反應(yīng)時(shí)間及穩(wěn)定性

對(duì)乙?；嫉扰cBSA 反應(yīng)迅速，室溫下（15 ℃～20 ℃）瞬間達(dá)到穩(wěn)定，1 h 內(nèi)吸光度保持不變。試驗(yàn)了30 ℃和35 ℃（水?。┑姆磻?yīng)時(shí)間及穩(wěn)定性，結(jié)果表明溫度影響不明顯。

2.5 離子強(qiáng)度的影響

加入NaCl 測(cè)試了體系的離子強(qiáng)度，結(jié)果表明，NaCl 的濃度為0.01 mol/L，體系的吸光度提高7.6%，隨著NaCl 加入量增加，吸光度又逐漸降低，當(dāng)NaCl 濃度達(dá)到0.1 mol/L 吸光度提高7.6%，隨著NaCl 加入量增加，吸光度又逐漸降低，當(dāng)NaCl 濃度達(dá)到0.1 mol/L時(shí)，體系吸光度降低50%。離子強(qiáng)度的影響進(jìn)一步表明對(duì)乙?；嫉扰cBSA 之間主要是通過(guò)靜電作用結(jié)合的。

2.6 表面活性劑和有機(jī)溶劑的影響

分別試驗(yàn)了陽(yáng)離子表面活性劑（CPB），陰離子表面活性劑（SDS），中性表面活性劑（OP、TrittonX-100），無(wú)水乙醇對(duì)體系吸光度的影響，結(jié)果表明：加入CPB、SDS，體系吸光度迅速減小，當(dāng)CPB 為0.005%時(shí)，吸光度減少99.3%，SDS 為0.001%，吸光度減少27.8%；OP 對(duì)吸光度影響不大；TrittonX-100 和無(wú)水乙醇，使吸光度增加，其中TrittonX-100 加入0.1%，吸光度提高23%。實(shí)驗(yàn)選用0.1%的TrittonX-100。

2.7 精密度

取10 份濃度均為7.35×10-6mol/L 的BSA 溶液，按照試驗(yàn)方法進(jìn)行平行測(cè)定，吸光度的平均值0.404，RSD0.46%。

2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在試驗(yàn)條件下，研究了對(duì)乙?；嫉扰c牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、卵蛋白（OVA）、溶菌酶（LYS）、酪蛋白（CAS）的響應(yīng)情況，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線列于表1。

從表1 中結(jié)果可知，靈敏度高，線性范圍寬是本方法的突出優(yōu)點(diǎn)，一向響應(yīng)較低的卵蛋白也有較高的靈敏度。還具有BSA 和HSA 響應(yīng)接近、酪蛋白靈敏度更高的特點(diǎn)。

表1 蛋白質(zhì)的工作曲線Table 1 Calibration curve of proteins

2.9 干擾離子的影響

用本方法對(duì)有可能干擾的一些物質(zhì)，按大豆中各組分物質(zhì)的實(shí)際含量進(jìn)行測(cè)定[7-8]，結(jié)果列于表2。

表2 干擾物質(zhì)的影響Table 2 Interfering of substances

結(jié)果表明，大豆中存在的無(wú)機(jī)離子，產(chǎn)生的誤差均在±5%以內(nèi)，基本不干擾。

3 樣品測(cè)定

樣品制備：準(zhǔn)確稱取干豆粉（黃豆，黑豆）1 g 于60 ℃烘干，粉碎，過(guò)100 目篩，加溫水10 mL 浸泡30 min，于50 ℃下攪拌50 min，于4 000 r/min 下離心分離。取5 mL上層提取液，加2 mL 四氯化碳，攪拌，離心分離，取上層液1 mL，稀釋50 倍備用。

樣品測(cè)定：按照試驗(yàn)方法，測(cè)其結(jié)果及回收率見(jiàn)表3。

結(jié)果表明，對(duì)乙酰基偶氮羧光度法測(cè)定豆類(lèi)中可溶性蛋白含量為：黃豆0.36 mg/mL，黑豆0.38 mg/mL，回收率符合生化分析要求。

表3 樣品中蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 3 Assay results of proteins of sample（n=3）

4 結(jié)論

在酸性條件下，有機(jī)試劑對(duì)乙酰基偶氮羧與無(wú)色的大豆蛋白及TrittonX-100 形成三元反應(yīng)體系，生成藍(lán)色多元可溶性復(fù)合物，該復(fù)合物在波長(zhǎng)669 nm 處的表觀摩爾吸光系數(shù)為3.09×105L/（mol·cm），蛋白質(zhì)在10 μg/mL～100 μg/mL（BSA）范圍內(nèi)遵循比爾定律，以此建立了選擇性及靈敏度較高的蛋白質(zhì)測(cè)定新方法，用于大豆中可溶蛋白質(zhì)的測(cè)定，操作簡(jiǎn)便，克服了經(jīng)典方法中測(cè)定非蛋白氮的不足，為準(zhǔn)確測(cè)定大豆水溶性蛋白質(zhì)提供了一種科學(xué)安全的原理和方法。

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