李粉玲，蔡漢權(quán)，洪仰純

（廣東韓山師范學(xué)院，廣東 潮州 521041）

20 世紀(jì)初，由于膜的化學(xué)功能、免疫物質(zhì)的化學(xué)研究與發(fā)展以及新藥物資源的尋找與研究等，發(fā)現(xiàn)糖類在生物體中的作用不僅是作為能量資源或結(jié)構(gòu)材料，更重要的是廣泛參與細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞生長、分化、代謝、胚胎發(fā)育、細(xì)胞癌變、病毒感染、免疫應(yīng)答等生命現(xiàn)象中細(xì)胞的各種活動(dòng)，具有多種多樣的生物學(xué)功能，因此糖的研究開始逐步活躍起來。其中，一些分子量在幾千以上，具有很強(qiáng)生物活性的活性多糖的研究受到日益重視，它們的生理活性、化學(xué)結(jié)構(gòu)以及構(gòu)效關(guān)系成為多糖研究的前沿陣地，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和食品功能化學(xué)共同關(guān)注的焦點(diǎn)。

多糖作為水果中的一類重要結(jié)構(gòu)物質(zhì)與功能物質(zhì)，在各種水果中均大量存在。這些多糖不僅賦予果實(shí)一定的質(zhì)構(gòu)特性和感官品質(zhì)，而且在果實(shí)病蟲害防御等方面具有重要的作用，因此常常成為水果成熟度判定、貯藏加工、品質(zhì)分析控制和病害防治研究中的一項(xiàng)重要指標(biāo)。從2001 年來隨著天然活性多糖研究的深入，大量的水果多糖資源不斷被發(fā)掘利用，目前已報(bào)道的水果活性多糖種類達(dá)幾十種，幾乎涉及到所有常見水果種類[1]。

蓮霧（Syzygium samarangense Merr.etPerry.），又名金山蒲桃、洋蒲桃、輩霧、璉霧、爪哇蒲桃、水蒲桃等，是桃金娘科蒲桃屬熱帶常綠喬木果樹，原產(chǎn)馬來半島及安達(dá)曼群島，是著名的熱帶水果。蓮霧的用途很廣，蓮霧樹速生快長，周年常綠，樹姿優(yōu)美；花期長，花濃香，花形美麗；掛果期長，果實(shí)營養(yǎng)豐富，是營養(yǎng)全面的水果，被稱為“水果皇帝”。同時(shí)在食療上有清熱、利尿、安神、潤肺、止咳、除痰等功能，能輔助治療咳嗽、痔瘡、腹?jié)M、腸炎、痢疾、糖尿病等常見疾病[2]。文獻(xiàn)中對(duì)蓮霧的營養(yǎng)成分分析結(jié)果表明，蓮霧多糖含量較高[3]。本實(shí)驗(yàn)將利用微波技術(shù)這一現(xiàn)代手段輔助提取蓮霧多糖。

多糖的提取方法有堿提法、水提法、微波法、酶提法和超聲波輔助提取法等。本試驗(yàn)采用的是微波輔助提取法，微波萃取技術(shù)即微波輔助萃?。∕icrowavessisted extraction，MAE），是用微波能加熱與樣品相接觸的溶劑，將所需化合物從樣品基體中分離，進(jìn)入溶劑中的一個(gè)過程。微波提取技術(shù)具有快速、溶劑用量少、提取率高、成本低、質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)[4-6]。

微波提取可用于大生產(chǎn)，其安全可靠，無污染，屬于綠色工程，生產(chǎn)線組成簡單，并可節(jié)省投資。十多年來，此項(xiàng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品、生物樣品及環(huán)境樣品的分析與提取。在多糖提取方面微波提取技術(shù)已應(yīng)用于南瓜多糖、柑橘皮多糖、赤靈芝孢子多糖等的提取[7-10]。

微波萃取在用于某些生物材料的多糖提取中被證實(shí)可明顯提高提取率。張海容[11]等人以香菇多糖為研究對(duì)象，采用單因素分組實(shí)驗(yàn)法對(duì)香菇多糖提取工藝（熱水法和微波提取法）進(jìn)行了初步的探討，比較了時(shí)間，浸取溫度，浸取次數(shù)，液固比等因素對(duì)多糖提取率的影響。其中傳統(tǒng)熱水提取法的最佳工藝條件為：液固比10，加熱溫度45 ℃，加熱時(shí)間5 h，提取二次。微波法提取香菇多糖的最佳工藝條件：液固比10，功率40%，加熱時(shí)間180 s，PH 值1。通過兩種最佳工藝條件的結(jié)果比較可知，微波萃取法具有節(jié)能、省時(shí)、環(huán)保、操作便利且提取率高等優(yōu)點(diǎn)。

國內(nèi)微波能在農(nóng)業(yè)和食品加工業(yè)中應(yīng)用的技術(shù)水平與國外的有一定差距，但這并不妨礙它成為一條新的物料處理的有效途徑，其發(fā)展前景十分廣闊[12]。

用苯酚-硫酸法測定多糖含量，苯酚-硫酸法顯色原理為糠醛衍生物與2-萘酚縮合生成有色物質(zhì)，在490 nm 波長處有特征吸收，測定多糖含量。多糖在硫酸存在下先水解成果糖，再衍生成具有呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物——糠醛，甲基五碳糖生成的是5-甲基五碳糠醛，六碳糖生成的是5-羧甲基糠醛。測定吸光度時(shí)所用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與蓮霧多糖都需現(xiàn)配現(xiàn)用才能保證結(jié)果的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性，每組需平行測定3 次。用分光光度法測定蓮霧中多糖的含量，此方法簡單，準(zhǔn)確率高。且生成的顏色持久，用苯酚-硫酸法測定多糖含量時(shí)需注意苯酚濃度不宜太高，這樣反應(yīng)的穩(wěn)定性不好且易產(chǎn)生操作誤差。本實(shí)驗(yàn)采用5%濃度的苯酚，測定結(jié)果較為理想。同時(shí)保持較高的硫酸濃度對(duì)多糖含量測定非常重要，因此該呈色反應(yīng)是以對(duì)多糖的水解和糠醛反應(yīng)為基礎(chǔ)的，硫酸濃度降低會(huì)影響兩種反應(yīng)的進(jìn)行[13-14]。

1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器

1.1 材料

蓮霧（采自潮州市）

1.2 試劑

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，95%乙醇、苯酚、濃硫酸及其他試劑均為分析純。

5.0%苯酚試劑的配制：稱取苯酚100 g，加鋁片0.1 g 和NaHCO30.05 g 蒸餾，收集182 ℃餾分。稱取7.5 g，加水150 mL 溶解，置棕色瓶內(nèi)放冰箱備用，得5.0%苯酚試劑。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g，加適量水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，加蒸餾水至刻度搖勻，制得濃度為1 mg/mL 的葡萄糖溶液，再準(zhǔn)確移取10 mL，用蒸餾水定容至100 mL，得0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3 儀器

移液管；吸量管；容量瓶；碘量瓶；離心管；試管。

FA2004N 電子天平722SP 可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHD-III 循環(huán)水式多用真空泵：保定高新區(qū)陽光科教儀器廠；101A-1 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；冷藏冷凍箱：BCD-217YB Haier；組織搗碎機(jī)：金壇市醫(yī)療儀器廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-8：常州華普達(dá)教學(xué)有限公司；KDM 型調(diào)溫電熱套：山東鄄城永興儀器廠；800 型離心沉淀器：上海手術(shù)器械廠；ET-Q 型氣浴恒溫振蕩器：常州榮冠實(shí)驗(yàn)分析儀器廠。

2 方法

2.1 蓮霧多糖的提取工藝

2.1.1 蓮霧的預(yù)處理

將蓮霧洗凈切碎，放在101A-1 型電熱鼓風(fēng)干燥箱以60℃左右烘烤，粉碎，過40 目篩，于試劑瓶中密封備用。

2.2 多糖含量的測定

苯酚-硫酸法。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（0.1 mg/mL）0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加水稀釋至1 mL，向各管中加入5%苯酚試劑1 mL，混勻。沿管壁加入濃硫酸5 mL，靜置5 min，振搖，置沸水浴中加熱15 min，立即轉(zhuǎn)入冷水浴中冷卻至室溫。以蒸餾水為空白，在490 nm 波長處測定吸光度。以葡萄糖的含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線得直線回歸方程

2.3 蓮霧多糖含量測定

取蓮霧多糖浸提液溶于適量蒸餾水中，轉(zhuǎn)移到100 mL 容量瓶中，定容。精密吸取上述溶液1.0 mL，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線制作”項(xiàng)下操作，測定吸光度，根據(jù)回歸方程求出含量。

計(jì)算公式：

提取液多糖含量（mg）=c×V

式中：c 為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的葡萄糖濃度，（mg/mL）；V 為蓮霧多糖溶液稀釋后的總體積，mL；W 為提取多糖時(shí)稱取的蓮霧重量，g。

3 結(jié)果與討論

3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按照2.2 操作所得數(shù)據(jù)（如表1）制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作Table 1 The production of glucose standard curve

以吸光度A 為縱坐標(biāo)，葡萄糖的濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，做葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 glucose standard curve

3.2 蓮霧多糖提取工藝流程

準(zhǔn)確稱取5.00 g 蓮霧樣品于索氏提取器中用石油醚（80 ℃）回流脫脂兩次，1 h/次，每次60 mL。再用95 %乙醇回流提取兩次，1 h/次，每次60 mL。除去單糖和低聚糖，將其烘干[15]。再進(jìn)行稱重，將其平均分成5 份，放入5 個(gè)碘量瓶中，按一定比例加入蒸餾水（料液比），在合適功率（微波功率）下微波浸提數(shù)秒（浸提時(shí)間），浸提結(jié)束后趁熱減壓抽濾，收集濾液。

相同條件下，再將濾渣洗入碘量瓶中二次浸提，浸提數(shù)次（浸提次數(shù)）后，合并濾液，加熱濃縮至2 mL～3 mL（原料重∶濃縮液=1∶2）。

加入4 倍體積的95℅乙醇，充分?jǐn)嚢瑁湃氡渲徐o置2 h，在4 000 r/min 下，離心15 min。收集沉淀。沉淀物用無水乙醇洗滌，如此重復(fù)數(shù)次，直到乙醇接近無色，得到的沉淀即為粗多糖。

得到的粗多糖加50 mL 的蒸餾水使其重新溶解，加入Sevage 試劑[16-17]（正丁醇：氯仿=5∶1），振蕩15 min，靜置2 h，脫去蛋白，過濾，取其濾液，用蒸餾水溶解后定容100 mL 容量瓶中，利用苯酚-硫酸法測其吸光度A，根據(jù)回歸方程可算出多糖的含量W。

原料的微波浸提時(shí)間、微波功率、料液比以及微波浸提次數(shù)對(duì)多糖的提取結(jié)果均有影響，據(jù)以上流程，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多糖提取量為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定微波萃取蓮霧多糖的最佳條件。

以提取多糖的因素為橫坐標(biāo)，多糖含量（mg/g）為縱坐標(biāo)做圖分析比較。

3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

3.3.1 微波浸提時(shí)間對(duì)蓮霧多糖提取的影響

將5.0 g 回流烘干的蓮霧粉末平均分成5 份于250 mL 碘量瓶中，按照料液比1∶40（g/mL）加入40 mL水，在微波功率60%（480 W）條件下分別浸提30、60、90、120、150 s，趁熱過濾，苯酚-硫酸法測定多糖的提取量，結(jié)果見圖2。

圖2 蓮霧多糖含量與微波浸提時(shí)間的關(guān)系Fig.2 Effects of microwave extraction time on the content of lotus fog polysaccharide

從圖2 看出微波加熱浸提120 s 時(shí)多糖提取量最大，浸提時(shí)間小于120 s 多糖提取不充分，浸提時(shí)間大于120 s，隨著時(shí)間的延長，多糖提取量逐漸降低，可能與較高溫度下加熱浸提時(shí)間過長導(dǎo)致多糖降解有關(guān)。

3.3.2 微波浸提功率對(duì)蓮霧多糖提取的影響

將5.0 g 回流烘干的蓮霧粉末平均分成5 份于250 mL 碘量瓶中，加入40 mL 蒸餾水，分別在20 %、40 %、60%、80%、100%（100%功率為800 W）功率下加熱浸提120 s，趁熱過濾，苯酚-硫酸法測定多糖含量計(jì)算提取量，結(jié)果見圖3。

圖3 蓮霧多糖含量與微波浸提功率的關(guān)系Fig.3 Effects of microwave power on the content of lotus fog polysaccharide

由圖3 看出蓮霧水溶性多糖的提取量先是隨著微波功率的增加而增大，功率80%時(shí)多糖提取量最大。隨著微波功率的加大，微波的熱效應(yīng)能夠快速提升浸提液的溫度，有利于待提取物質(zhì)擴(kuò)散到溶劑中，而且微波具有穿透特性使蓮霧細(xì)胞破壁，使水更容易浸入，多糖有效成分容易浸出。但當(dāng)微波功率大于80%后，多糖提取量率開始降低，可能由于微波萃取功率過高，浸提液較長時(shí)間處于高溫條件下，對(duì)多糖會(huì)產(chǎn)生一定的降解作用。

3.3.3 料液比對(duì)蓮霧多糖提取的影響

將5.0 g 回流烘干的蓮霧粉末平均分成5 份于250 mL 碘量瓶中，按料液比1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100（g∶mL）加入相應(yīng)體積的水，微波功率80%（640 W），加熱浸提120 s，測定多糖提取量，結(jié)果見圖4。

圖4 蓮霧多糖含量與料液比的關(guān)系Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on the content of lotus fog polysaccharide

從圖4 可知，當(dāng)料液比 為1∶40（g∶mL）時(shí)達(dá)到最高提取量，為此，選擇料液比1∶40（g∶mL）為提取條件。

3.3.4 微波浸提次數(shù)對(duì)蓮霧多糖提取量的影響

將3.0 g 回流烘干的蓮霧粉末平均分成3 份于250 mL 碘量瓶中，根據(jù)上述試驗(yàn)所得最佳浸提條件：浸提時(shí)間120 s、微波功率80%，料液比1∶40（g∶mL）、研究多糖浸提次數(shù)對(duì)多糖提取量的影響，分別浸提一至三次，結(jié)果見圖5。由圖5 可看出二次浸提時(shí)樣品液中多糖含量達(dá)到最大值，因此二次浸提為最佳的浸提次數(shù)。

圖5 蓮霧多糖含量與微波浸提次數(shù)的關(guān)系Fig.5 Effects of times on the content of lotus fog polysaccharide

3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在微波浸提時(shí)間、微波功率、料液比以及微波浸提次數(shù)對(duì)蓮霧多糖提取率影響單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2、表3。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

表3 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 L9（34）Orthogonal experimental design and test results

表3 中極差值大小反映出影響蓮霧多糖提取率的主次因素順序?yàn)榻岽螖?shù)＞微波功率＞料液比＞微波時(shí)間，經(jīng)方差分析顯示微波浸提次數(shù)和微波功率是顯著影響因素。

4 結(jié)論

4.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)通過三水平四因素正交試驗(yàn)，確定了蓮霧多糖的最佳提取條件，即為：微波浸提時(shí)間為120 s、微波功率80%（640 W）、料液比1∶40（g∶mL），浸提次數(shù)3 次。

由于該組合未出現(xiàn)在試驗(yàn)中，需要測定該條件下蓮霧多糖的提取率，經(jīng)測定，蓮霧在該條件下的提取量達(dá)到12.64 mg/g，高于正交試驗(yàn)中出現(xiàn)的最高提取率，說明正交試驗(yàn)確定的最佳微波萃取條件是合理的。

4.2 前景展望

近幾年來研究較多的是蓮霧的組織和規(guī)?；a(chǎn)以及分析蓮霧的營養(yǎng)成分，目前對(duì)植物多糖的提取技術(shù)有較深入的研究，而對(duì)于提取果實(shí)多糖的研究，仍處于初始研究階段，目前微波萃取技術(shù)的應(yīng)用基本上還停留在實(shí)驗(yàn)室小樣品的提取及分析，使用設(shè)備簡陋，工業(yè)化微波提取器尚未見報(bào)道。而對(duì)于蓮霧這種產(chǎn)量豐富，極易栽培，掛果期長的特點(diǎn)來說，一旦這些設(shè)備應(yīng)用于大生產(chǎn)，必將對(duì)食品、香料業(yè)、傳統(tǒng)中藥制藥業(yè)等相關(guān)行業(yè)帶來巨大的革命，大大提高蓮霧的利用價(jià)值，具有一定的開發(fā)意義。

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