殷軍帥，梁秋麗，方佳茂，羅石柱，孫中濤，*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018；2.廣東環(huán)西生物工程有限公司，廣東 普寧 515300）

Monacolin K 又 稱Lovastatin、mevinolin 和Mevacor，是一種抑制膽固醇合成的藥物，最初由日本學(xué)者遠(yuǎn)滕章（Akira Endo）于1979 年從紅曲霉（Monascus ruber）的次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)[1]，隨后陸續(xù)從土曲霉（Aspergillus terreus）、青霉屬（Penicillium）和木霉屬（Trichoderma） 等真菌的次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)[2]。Monacolin K 可通過競爭性抑制膽固醇合成限制酶—3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶（HMG-CoA）的活性而抑制膽固醇的合成，從而降低人類和動物的血漿膽固醇水平[3-4]。此外，Monacolin K 還具有抑制腫瘤，預(yù)防和治療動脈硬化、冠心病、高血壓、肥胖癥等作用[5-8]。

目前，Monacolin K 主要是以紅曲霉通過固態(tài)發(fā)酵或液態(tài)發(fā)酵的方式進(jìn)行生產(chǎn)。歐美等西方國家推崇液態(tài)發(fā)酵，主要是因?yàn)槠渥詣踊潭雀摺趧訌?qiáng)度低、生產(chǎn)效率高；但液態(tài)發(fā)酵設(shè)備投資大、能耗高、發(fā)酵液產(chǎn)物濃度低，提取困難、生產(chǎn)成本高。固態(tài)發(fā)酵具有液態(tài)發(fā)酵不可比擬的優(yōu)勢，主要是設(shè)備投資小、能耗低、生產(chǎn)過程節(jié)水、生產(chǎn)成本低、無廢水廢渣產(chǎn)生、不會造成二次污染，并且固態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)物可以全部被利用，從而省去了復(fù)雜的提取過程，可進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本[9-10]。因此，固態(tài)發(fā)酵是國內(nèi)Monacolin K 最主要的生產(chǎn)方式。

Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）已廣泛地應(yīng)用于發(fā)酵工藝優(yōu)化，其中包括Moancolin K 的液態(tài)發(fā)酵工藝[11-12]，但少有用于Moancolin K 固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化的報(bào)道[13]。本篇論文采用Plackett-Burman 與Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對紅曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K 的工藝進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化，以提高M(jìn)onacolin K 的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

紅色紅曲霉（Monascus ruber MY-01）：由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院發(fā)酵工程研究室分離保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種保藏培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30、蛋白胨20、硝酸鈉2、磷酸二氫鉀1、硫酸鎂1、pH 自然；固體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：市售粳米50 g，放于250 mL 的三角瓶中，加水浸泡2 h，于0.08 MPa 滅菌20 min[14]。

1.1.3 主要儀器和試劑

LC-310 液相色譜儀：江蘇天瑞儀器股份有限公司；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋：龍口市先科儀器公司；DHZ-D 大容量全溫振蕩器：太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；HJ-CF-2D 型雙人凈化工作臺：上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；Monacolin K 標(biāo)準(zhǔn)樣：浙江海正藥業(yè)；甲醇、乙腈為國產(chǎn)色譜純；葡萄糖、麥芽糖、甘油、蔗糖、蛋白胨、無水乙醇、無機(jī)鹽等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)：挑取1 環(huán)新鮮菌種接種于菌種保藏培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。三角瓶種子培養(yǎng)：將斜面菌種用5 mL 無菌水洗下孢子，吸取1 mL 接種于裝有200 mL 種子培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶中，30 ℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)48 h。固態(tài)發(fā)酵：將三角瓶種子液接種于裝有50 g 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，于30 ℃的恒溫培養(yǎng)12 d。

1.2.2 Monacolin K 的檢測[2]

準(zhǔn)確稱取MonacolinK 標(biāo)準(zhǔn)樣品0.0200 g，于100 mL的容量瓶中用甲醇定容，配成濃度為0.2 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

固態(tài)發(fā)酵樣品于40 ℃烘干至恒重，研磨成粉末，取2 g 粉末樣品加入裝有100 mL 甲醇∶蒸餾水（1∶1，體積比）萃取液的250 mL 三角瓶中，于30 ℃，200 r/min萃取2 h，然后10 000 r/min 離心10 min，取上清液用0.45 μm 微膜過濾，收集濾液待測。Monacolin K 檢測采用高效液相色譜法，色譜柱為C18柱，流動相為0.02 mol/L 磷酸緩沖液（pH 7.7）∶乙腈=65∶35（體積比）；紫外檢測器的波長為238nm，體積流量為1mL/min。

1.2.3 干重減重

固態(tài)培養(yǎng)時，直接測量絲狀真菌的生物量十分困難，這是因?yàn)楹茈y從固體基質(zhì)中將菌絲體分離出來。Terebiznik and Pilosof[15]發(fā)現(xiàn)菌絲體的生長量與基質(zhì)的干重減重呈正相關(guān)，因此可以通過測定基質(zhì)的干重減重來間接反映真菌在固態(tài)發(fā)酵體系中的生長狀況。

1.2.4 最佳附加碳源與氮源的選擇

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別加入2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘油、麥芽糖、乳糖，按上述方法進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以確定最佳附加碳源的種類，然后再通過0%、2%、4%、6 %、8 %、10 %、12%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）等7 個水平的單因素試驗(yàn)確定其最佳用量。

在最佳附加碳源優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，分別加入1 %（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的蛋白胨、酵母浸粉、硝酸銨、氯化銨、硝酸鈉，按上述方法進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以確定最佳附加氮源的種類，然后再通過0 %、1 %、2 %、3 %、4 %、5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）等6 個水平的單因素試驗(yàn)確定其最佳用量。

1.2.5 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用7 因素的Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察培養(yǎng)基含水量、裝瓶量、接種量、pH、溫度、附加碳源和氮源等因素對Monacolin K產(chǎn)量的影響，以確定其顯著因素。各因素及其水平見表1。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析均采用軟件Design Expert 7.1（Stat-Ease Corp.，Minneapolis，MN，USA）。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)的因素和水平Table 1 The coded and uncoded values of factors in Plackett-Burman design

1.2.6 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)對影響Monacolin K 產(chǎn)量的3個顯著性因素作進(jìn)一步的優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)因素與水平見表2。采用最小二乘法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合得二元多項(xiàng)方程為：

式中：Y 為Monacolin K/（mg/g）；xi，xj為自變量代碼值；βo為常系數(shù)；βi為線性系數(shù)；βii為二次項(xiàng)系數(shù)；βij為交互項(xiàng)系數(shù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析均采用軟件Design Expert 7.1 （Stat-Ease Corp.，Minneapolis，MN，USA）。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)的因素和水平Table 2 Experimental ranges and levels of the independent variables in Box-Behnken design

1.2.7 發(fā)酵時間對基質(zhì)干重減重和Monacolin K 產(chǎn)量的影響

取數(shù)個三角瓶，按照所優(yōu)化后的條件進(jìn)行發(fā)酵。從第1 天開始，每隔1 天取1 次樣，每次做3 個平行。按上述方法檢測并分析數(shù)據(jù)，以探討發(fā)酵時間對基質(zhì)干重減重和Monacolin K 產(chǎn)量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 附加碳源對Monacolin K 產(chǎn)量的影響

本實(shí)驗(yàn)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加的數(shù)種附加碳源對Monacolin K 產(chǎn)量的影響見圖1 所示。

圖1 附加碳源對Monacolin K 產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of extra carbon sources on the production of Monacolin K

由圖1 可知，附加碳源葡萄糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖、乳糖等碳源均可顯著提高發(fā)酵水平（P＜0.01），其中以添加葡萄糖、蔗糖和麥芽糖時Monacolin K 的產(chǎn)量最高，三者之間差異不顯著（P＞0.01）。綜合考慮生產(chǎn)成本，我們選用價格較低的葡萄糖為最適附加碳源。此結(jié)果與魏培蓮等[16]的研究結(jié)果一致，但在熊曉輝等[17]的研究中甘油是最佳碳源，這可能因?yàn)樗捎玫募t曲霉菌株不同，其生理特性存在差異。另外，通過實(shí)驗(yàn)可知附加碳源葡萄糖的添加量對紅曲霉生長量和Monacolin K 的產(chǎn)量有很大的影響，見圖2。

圖2 葡萄糖含量對Monacolin K 產(chǎn)量與干重減重的影響Fig.2 Effect of glucose on the production of Monacolin K and dry matter weight loss

由圖2 可知，當(dāng)葡萄糖的含量為2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時，基質(zhì)的干重減重最大，紅曲霉菌絲體生長最好，此時的Monacolin K 的產(chǎn)量最高，為12.62 mg/g。

2.2 附加氮源對Monacolin K 產(chǎn)量的影響

本實(shí)驗(yàn)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加的數(shù)種附加氮源對Monacolin K 產(chǎn)量的影響見圖3 所示。

圖3 附加氮源對Monacolin K 產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of extra nitrogen sources on the production of Monacolin K

由圖3 可知，蛋白胨作為附加氮源時，Monacolin K的產(chǎn)量遠(yuǎn)高于酵母浸粉、硝酸銨、氯化銨和硝酸鈉等作為附加氮源時Monacolin K 的產(chǎn)量，其差異達(dá)到了顯著水平（P＜0.01）。此結(jié)果與董永勝等[18]的研究結(jié)果一致，但在熊曉輝等[17]的研究中，玉米漿是最佳氮源，這表明不同的生產(chǎn)菌株，其最適氮源也存在差異。蛋白胨含量對Monacolin K 產(chǎn)量與干重減重的影響見圖4。

圖4 蛋白胨含量對Monacolin K 產(chǎn)量與干重減重的影響Fig.4 Effect of peptone on the production of Monacolin K and dry matter weight loss

由圖4 可知，蛋白胨的添加量對紅曲霉生長量和Monacolin K 的產(chǎn)量有很大的影響，其中當(dāng)?shù)鞍纂说暮繛?%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時，紅曲霉菌絲體生長的最好，基質(zhì)的干重減重最大，此時Monacolin K 的產(chǎn)量最高，為12.34 mg/g。

2.3 Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果

Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果如表3 所示，采用Design Expert 7.1 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行一次多項(xiàng)回歸擬合，獲得一次回歸方程：

式中：Y 為Monacolin K，（mg/g）；X1～X7為自變量的編碼值。該回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），相關(guān)系數(shù)R2=0.982 7，這表明其擬合度和可信度均很高，實(shí)驗(yàn)中98.27%的變異可由該模型進(jìn)行解釋。

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 The design and results of Plackett-Burman design for the production of Monacolin K

方程系數(shù)的方差分析結(jié)果如表4 所示。

表4 Plackett-Burman 試驗(yàn)回歸分析結(jié)果Table 4 Results of the Plackett-Burman design regression analysis for the production of Monacolin K

培養(yǎng)基含水量（X1）與接種量（X3）對Monacolin K產(chǎn)量的影響達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01），為正效應(yīng)，裝瓶量（X2）為顯著水平（P＜0.05），是負(fù)效應(yīng)；但其它各因素的影響均不顯著（P＞0.05）。顯著性因素（X1、X2與X3）將采用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化。非顯著性因素中X4為負(fù)效應(yīng)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)直接采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)中的低水平為最佳水平，即pH 5；X5、X6、X7為正效應(yīng)，但因?yàn)槠錇榉秋@著因素，考慮到生產(chǎn)上節(jié)約成本，后續(xù)實(shí)驗(yàn)也直接采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)中的低水平為最佳水平，即28 ℃、葡萄糖1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、蛋白胨1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

2.4 Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)選出的顯著因素，對X1、X2和X3采用3 因素3 水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化。為使擬合方程具有旋轉(zhuǎn)型和通用性，中心點(diǎn)重復(fù)5 次。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。利用Design Expert 7.1 統(tǒng)計(jì)軟件對表5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，二次回歸模型的方差分析見表6。

通過Design Expert 7.1 軟件對表5 的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得Y 對X1（培養(yǎng)基含水量）、X2（裝瓶量）和X3（接種量）3 個因素的二次多項(xiàng)式回歸方程為：

表5 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 5 Experimental design and results of Box-Behnken designed experiments for the production of Monacolin K

表6 二次回歸模型的回歸分析結(jié)果Table 6 Regression results from the data of Box-Behnken designed experiments

式中：Y 為Monacolin K，（mg/g）；X1、X2與X3為自變量的編碼值。

由表6 方差分析可知，回歸模型極顯著（P＜0.01）、失擬項(xiàng)不顯著（P ＞0.05）、模型相關(guān)系數(shù)R2=0.959 0，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，能夠很好的對Monacolin K 的發(fā)酵工藝進(jìn)行預(yù)測。由回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，模型的一次項(xiàng)（X1、X2）、交互項(xiàng)（X1X3、X2X3）與二次項(xiàng)對Monacolin K 產(chǎn)量的影響顯著（P＜0.05），而一次項(xiàng)X3與交互項(xiàng)X1X2影響不顯著（P＞0.05）。表明各影響因素對產(chǎn)Monacolin K 的影響不是簡單的線性關(guān)系。由二次回歸方程可知，二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù)，說明拋物面開口向下，有最大值。求解二次回歸方程，可求出各因素的最佳水平（編碼值）：X1=-0.45、X2=-0.75、X3=0.26，解碼后可得其真實(shí)值，即：培養(yǎng)基含水量42.77%（mL/g）、裝瓶量46.26 g/（250 mL 三角瓶）、接種量8.52%（mL/g）。在此最佳條件下，模型預(yù)測的Monacolin K 的最大值為14.37 mg/g。為驗(yàn)證模型預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用上述最佳條件進(jìn)行了3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)測值為（14.03±0.53）mg/g，與預(yù)測值十分接近，這說明該模型是準(zhǔn)確有效的。

為了更直觀地描述X1、X2和X33 個因素對響應(yīng)值的影響，利用Design Expert 7.1 軟件繪制各因子對Monacolin K 的響應(yīng)面圖，如圖5 所示，響應(yīng)面存在最大值，即為模型所預(yù)測的最佳水平點(diǎn)。

2.5 發(fā)酵時間對干重減重和Monacolin K 產(chǎn)量的影響

圖5 培養(yǎng)基含水量、裝瓶量與接種量影響Monacolin K 產(chǎn)量的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot for the production of Monacolin K in terms of the effects of initial moisture content，bottle load and inoculation

圖6 發(fā)酵時間對干重減重和Monacolin K 產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of incubation time on the dry matter weight loss and production of Monacolin K

發(fā)酵時間對干重減重和Monacolin K 產(chǎn)量的影響如圖6 所示，前3 天菌體生長處于延遲期，基質(zhì)干重減重很小，幾乎沒有Monacolin K 產(chǎn)生；3 d～12 d 菌體生長進(jìn)入對數(shù)期，干重減重迅速增加。發(fā)酵前期（0 d～3 d）Monacolin K 僅有少許產(chǎn)生，但在發(fā)酵中后期（5 d～12 d）Monacolin K 大量產(chǎn)生。12 d 后，基質(zhì)的干重減重和Monacolin K 的增長速度均逐漸減慢，在第14 天時，Monacolin K 的產(chǎn)量達(dá)到最高，為（16.67±0.36）mg/g。

3 結(jié)論

本文通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman 與Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)對紅曲霉MY-01 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K 的工藝條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，確定了其最佳生產(chǎn)工藝：培養(yǎng)基含水量42.77%（mL/g）、裝瓶量46.26 g/（250 mL 三角瓶)、接種量8.52%（mL/g）、pH 5、葡萄糖1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、蛋白胨1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），于28 ℃恒溫培養(yǎng)14 d，Monacolin K 含量可達(dá)（16.67±0.36）mg/g，比基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了47.7%。此發(fā)酵水平遠(yuǎn)高于目前文獻(xiàn)報(bào)道的Moancolin K 固態(tài)發(fā)酵的生產(chǎn)水平[9，16-18]，對Moancolin K 的工業(yè)生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

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