高慧娟，劉雨晴，李娟輝，董瑞麗，王曉琴，賀旭陽，張萬恒，張芬琴，*

（1.河西學院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院，甘肅 張掖 734000；2.攀枝花市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，四川 攀枝花 617000）

桑黃是一類具有重要藥用價值的大型真菌，現(xiàn)代研究表明，桑黃多糖具有良好的抗癌和保肝護肝活性，并且無毒副作用，具有較高的經(jīng)濟價值。在我國，天然桑黃數(shù)量非常稀少，而桑黃菌的人工栽培尚處于起步階段，采用液體培養(yǎng)獲得具有藥理活性的菌絲體和胞外多糖，便于工業(yè)化生產(chǎn)[1]。研究結(jié)果表明，桑黃菌絲體的成分類似于子實體的活性成分[2]，蛋白質(zhì)含量和還原糖含量，分別是子實體中蛋白質(zhì)和還原糖含量的4 倍多，粗脂肪含量是子實體中含量的2 倍，脂肪酸含量和子實體中相當，氨基酸總量較子實體中高，種類豐富，還含有黃酮類物質(zhì)和酚類物質(zhì)，與野生子實體相比，具有較高的營養(yǎng)價值和開發(fā)價值[3]。

金屬元素對微生物的生長繁殖和正常代謝不可或缺[4]。研究不同金屬離子對桑黃菌絲體生長速度的影響，不僅可以確定有利于桑黃菌絲體生長的金屬離子，同時也可以提高菌絲體中金屬離子含量，為人體補充相應金屬離子，增加其藥用價值。目前，對于金屬離子對桑黃生長的影響的研究較少，本文通過平板培養(yǎng)和液體發(fā)酵，研究不同金屬離子對桑黃菌絲體生長速度、菌絲體干重、胞外多糖的含量的影響，為今后進一步開發(fā)利用桑黃提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑黃菌種：由河西學院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院微生物實驗室提供；PDA 培養(yǎng)基馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2 %，水1 000 mL，pH 自然。KCl、NaCl，CaSO4，MgSO4，F(xiàn)eSO4，ZnSO4，MnSO4，CuSO4為國產(chǎn)分析純。

BT8025B2H 型恒溫振蕩培養(yǎng)箱：深圳永業(yè)昌機電有限公司；MJX-160 型恒溫培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠；CL-32L 型高壓滅菌鍋：ALP 公司；5A2003 型精密電子天平：良平儀器；TQHZ-2002A 型臺式恒溫振蕩器：太倉市華美生化儀器廠；BDC-188 型冰箱：博西華家用電器有限公司；DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大量金屬元素對菌絲體生長的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入1.1 中所列的大量金屬元素，分別設(shè)不同的濃度（1、3、5、7 mg/mL 和9 mg/mL），每種濃度設(shè)3 次重復，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不加任何金屬離子作對照。試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，將培養(yǎng)基在121 ℃下滅菌30 min 后倒入65 mm 的平板中，每皿倒入15 mL；待培養(yǎng)基冷卻后，取直徑為6 mm 桑黃菌落一塊，置于平板中央，放在28 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)9 d，用十字交叉法測定菌落直徑，求出生長速度（mm/d），記載菌絲生長勢（長勢濃密用“+++”表示，較濃密用“++”表示，稀疏用“+”表示，不生長用“-”表示），以及菌落顏色和形狀[5]。

1.2.2 微量金屬元素對菌絲體生長的影響

將1.1 中所列的微量金屬元素分別加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基含有不同微量元素，并將同一微量元素在培養(yǎng)基中的含量配制成不同的濃度（0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL 和0.9 mg/mL），每種濃度設(shè)三次重復，試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計將培養(yǎng)基在121 ℃下滅菌30 min后倒入65 mm 的平板中，每皿倒入15 mL；待培養(yǎng)基冷卻后，取直徑為6 mm 桑黃菌落一塊，置于平板中央，放在28 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)9 d，用十字交叉法測定菌落直徑，求出生長速度（mm/d），記載菌絲生長勢（長勢濃密用“+++”表示，較濃密用“++”表示，稀疏用“+”表示，不生長用“-”表示），以及菌落顏色和形狀[5]。

1.2.3 菌絲體干重的測定

取三塊6 mm 直徑大小的桑黃菌絲體，加入含有金屬離子的PDA 培養(yǎng)基中，同一金屬離子濃度重復三次，置于28 ℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為130 r/min。培養(yǎng)7 d 后取出，紗布過濾后，用自來水沖洗三次，放入60 ℃烘箱中烘干至恒重，即為菌絲體干重[6]。

1.2.4 胞外粗多糖含量測定

取發(fā)酵液5 mL，加入10 mL 的乙醇，放入冰箱醇析過夜，得乳白色絮狀沉淀，然后用事先烘干稱重的濾紙過濾，再將含濾渣的濾紙放入60 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，則得到發(fā)酵液中粗多糖的含量[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大量金屬元素對桑黃菌絲體生長的影響

大量金屬元素對桑黃菌絲體生長的影響，見表1。

表1 大量金屬元素對桑黃菌絲體生長的影響Table 1 Effect of microelement on the mycelial growth of Phellinus igniarius

續(xù)表1 大量金屬元素對桑黃菌絲體生長的影響Continue table 1 Effect of microelement on the mycelial growth of Phellinus igniarius

由表1 中的結(jié)果表明：在分別含有3、5、7 mg/mL的Ca2+和1、3 mg/mL Mg2+的培養(yǎng)基上，桑黃菌絲體生長濃密、且菌絲生長速度顯著高于對照組；而分別在7 mg/mL 和9 mg/mL 的K+和Na+的培養(yǎng)基上菌絲體生長受到顯著的抑制作用，菌絲體顏色呈現(xiàn)淺黃色，菌絲體較稀疏，且菌絲生長速度顯著低于對照；分別含有1、3 mg/mL 的Na+，1 mg/mL K+，5 mg/mL Mg2+和9 mg/mL Ca2+的培養(yǎng)基上菌絲體生長速度較對照高，但是影響差異不顯著；而在3 mg/mL K+，7、3 mg/mL Mg2+和1 mg/mL Ca2+的培養(yǎng)基上，菌絲體生長速度較對照低，影響差異不顯著，結(jié)果見表1。說明較高濃度的Ca2+和Mg2+對桑黃菌絲體生長和胞外多糖分泌具有明顯的促進作用，而高濃度的K+和Na+對桑黃菌絲體生長具有明顯的抑制作用。

2.2 微量金屬元素對桑黃菌絲體生長的影響

微量元素對桑黃菌絲生長的影響，見表2。

表2 微量元素對桑黃菌絲生長的影響Table 2 Effect of trace element on the mycelium growth of Phellinus igniarius

續(xù)表2 微量元素對桑黃菌絲生長的影響Continue table 2 Effect of trace element on the mycelium growth of Phellinus igniarius

從表2 中可以看到：在分別含有0.5 mg/mL 和0.7 mg/mL 的Fe2+和0.1 mg/mL Cu2+的培養(yǎng)基上，桑黃菌絲體生長濃密、且菌絲生長速度顯著高于對照組；而在濃度高于0.1 mg/mL Cu2+，0.9 mg/mL Fe+，0.3、0.5、0.7、0.9 mg/mL Mn2+的培養(yǎng)基上的菌絲體生長受到顯著的抑制作用，菌絲體顏色呈現(xiàn)淺黃色，菌絲體稀疏；在0.3、0.5、0.7、0.9 mg/mL Zn2+，0.1、0.3 mg/mL Fe2+，的培養(yǎng)基上，桑黃菌絲體生長速度較對照低，但影響差異不顯著；在0.1 mg/mL Mn2+和0.1 mg/mL Zn2+培養(yǎng)基上，桑黃菌絲體生長速度較對照高，但影響差異不顯著。

2.3 金屬離子對桑黃菌絲體干重及胞外多糖含量的影響

對促進桑黃菌絲體生長的各種金屬離子加入到PDA 液體培養(yǎng)基中，桑黃菌絲體和胞外多糖含量見表3。

表3 金屬離子對桑黃菌絲體干重及胞外多糖含量的影響Table 3 Effect of metal ions on the Mycelium dry weight and Extracellular polysaccharide of the Phellinus igniarius

續(xù)表3 金屬離子對桑黃菌絲體干重及胞外多糖含量的影響Continue table 3 Effect of metal ions on the Mycelium dry weight and Extracellular polysaccharide of the Phellinus igniarius

從表3 中可以看到，3、5 mg/mL 和7 mg/mL Ca2+的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中菌絲體干重極顯著高于對照組，較空白對照菌絲體干重高出，1 mg/mL 和3 mg/mL Mg2+，3 mg/mL Na+以及0.7 mg/mL Fe2+的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中菌絲體干重顯著高于對照組；0.1 mg/mL Zn2+，3 mg/mL K+，3 mg/mL Na+，0.5 mg/mL Fe2+，7 mg/mL Ca2+和0.7 mg/mL Fe2+的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中胞外粗多糖的分泌顯著高于對照組。

2.4 結(jié)果討論

微生物在生長及其次級代謝過程各種金屬元素如鉀、鈉、鎂、錳、銅、鐵、鋅、鈣等起著極其重要的作用。鈣是微生物重要的陽離子，是蛋白酶的激活劑[8]；鎂在糖酵解、呼吸、氧化磷酸化等過程中起重要作用，是各種激酶，檸檬酸裂合酶和堿性磷酸酶等的輔助因子，是多種酶的激活劑，同時鎂對重金屬如鈷和鎳的毒性有拮抗作用；鐵是細胞色素和鐵氧化還原蛋白的氧化還原反應中必不可少的電子載體，在電子傳遞體系中起至關(guān)重要的作用；鋅是各種金屬蛋白酶、碳酸酶、醇脫氫酶等的輔助因子[9]。金屬離子是微生物生長繁殖不可或缺的營養(yǎng)要素，也是微生物正常代謝必不可少的一類營養(yǎng)物質(zhì)[4]。在C/N 一定的條件下，培養(yǎng)基中的金屬離子對細胞生長有著重要的影響[10]。適量的金屬離子可以對真菌的生長，次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)具有明顯的作用[11]。

金屬離子對桑黃菌絲體生長和胞外多糖分泌也有重要影響，Ca2+，Na+，Mg2+和Fe2+對菌絲體生長具有明顯的促進作用，菌絲體干重明顯高于對照組，Na+，Zn2+，K+，和Fe2+對桑黃胞外多糖的分泌具有促進作用，而Fe2+，Mg2+，Ca2+在較大濃度時促進桑黃菌的生長。桑黃菌對金屬離子尤其是Cu2+、Mn2+、Zn2+等微量金屬離子的需要量極少，這些離子在較低濃度時能刺激生長與代謝，對桑黃菌的生長有促進作用，高濃度有抑制作用因為它們會和必要的其他技術(shù)競爭含硫化合物和氧的結(jié)合位點，破壞核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，干擾氧化磷酸化和滲透壓平衡。另外，培養(yǎng)基中加入金屬鹽離子，會引起細胞滲透壓的變化，從而影響真菌的生長，高濃度的重金屬可以抑制微生物的生長和繁殖、阻遏呼吸作用、使細胞形態(tài)異常甚至使細胞裂解、改變核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、干擾氧化磷酸化、影響細胞滲透壓平衡、重金屬脅迫培養(yǎng)對微生物生長的影響[12]。

3 結(jié)論

1）不同濃度的大量金屬元素對桑黃菌絲體生長速度的影響不同，3、5mg/mL 和7mg/mL 的Ca2+和1mg/mL 和3mg/mLMg2+促進菌絲體生長；在7mg/mL 和9 mg/mL 的K+，7 mg/mL 和9 mg/mL Na+抑制菌絲體生長。

2）在液體搖瓶發(fā)酵中，3、5、7 mg/mL Ca2+，1、3 mg/mL Mg2+，3 mg/mL Na+和0.7 mg/mL Fe2+的培養(yǎng)基促進菌絲體干重量的積累，是空白菌絲體干重量的5 倍～8 倍；而0.1 mg/mL Zn2+，3 mg/mL K+，3 mg/mL Na+，0.5、0.7 mg/mL Fe2+，7 mg/mL Ca2+和的培養(yǎng)基促進胞外粗多糖的分泌，3 mg/mLNa+中胞外多糖含量高達0.7105g/100mL。

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