林春榕，羅永會，張翠香，韓紅，胡志強，左紹遠

（1.大理學院基礎醫(yī)學院，云南 大理 671000，2.大理學院基礎醫(yī)學院2004級醫(yī)學檢驗班，云南 大理 671000）

白雪茶（Thamnolia vermicularis（Sw.）Ach），又稱地衣，太白茶，為地衣類地茶科地茶屬植物，全株呈白色或灰綠色，管狀，長3 cm～7 cm，直徑3 mm～5 mm。雪茶為耐寒植物，生長于海拔4 000 m 以上的高山地區(qū)，在云南的迪慶、麗江、大理蒼山等地區(qū)分布較廣泛，在滇西北地區(qū)一直作為一種傳統(tǒng)飲品及旅游食品使用。雪茶性寒，具有清熱、消暑、生津止渴等功效[1]，對中暑、肺熱咳嗽、高血壓及肥胖等有一定防治作用[1]。多糖是一類結構復雜的生物大分子物質，具有多種復雜而廣泛的生物學活性[2-4]，已成為功能性食品新資源的研究開發(fā)的熱點之一。我們前期研究表明，白雪茶多糖具有促進免疫功能的作用[5]。為綜合開發(fā)利用云南白雪茶資源，我們對云南麗江產(chǎn)白雪茶中多糖的分離提取工藝及其在體外抗氧化活性進行了研究，以期為研究開發(fā)白雪茶深加工食品、擴大白雪茶的用途提供參考。

1 材料

1.1 試劑與原料

D-葡萄糖標準品：Sigma 公司；硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、三羥甲基氨基甲烷、無水乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇、三氯甲烷、硫酸等試劑：均為國產(chǎn)化學分析純。白雪茶，云南麗江紅葉土特產(chǎn)經(jīng)營公司產(chǎn)品（批號：20101102）。

1.2 儀器

HH-W420/600 恒溫水浴箱：金壇市瑞華儀器有限公司；AG 135 電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；RE-52A 型旋轉蒸發(fā)儀：上海亞東生化儀器廠；FD-1型冷凍干燥機：北京博醫(yī)康技術有限公司；UV2550 型紫外可見分光光度計：日本島津蘇州儀器有限公司；TDL-5-A 低速臺式大容量離心機：上海安亭科學儀器純廠。

2 方法

2.1 標準曲線的繪制[6]

精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標準品100.0 mg 置100 mL 容量瓶中，用蒸餾水溶解后，稀釋至100 mL 定容，得葡萄糖標準儲備液。吸取儲備液10.0 mL 置100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容，得葡萄糖標準應用液（100 μg/mL）。精密吸取應用液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80 mL，分別置于具塞試管，補蒸餾水至總體積2.0 mL，加6.0 %苯酚試劑1.0 mL后，各管迅速加濃H2SO45.0 mL，搖勻，沸水加熱10 min，迅速流水冷卻，另取2.0 mL 蒸餾水，同法操作，加入試劑作空白對照，在490 nm 測定吸光度。以吸光度為縱坐標，葡萄糖質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.2 白雪茶多糖的提取工藝流程與多糖提取率的測定

稱取白雪茶200.0 g，粉碎后用石油醚、95%乙醇各回流1 次，每次2 h。濾渣加蒸餾水水浴浸提2 次，合并濾液，減壓濃縮至適當體積后加95%乙醇至乙醇體積分數(shù)為75%醇沉，置4 ℃過夜，離心，沉淀用Sevag法脫蛋白[6]至280 nm 無明顯蛋白吸收峰后，加95%乙醇至乙醇體積分數(shù)為80%醇沉，沉淀用蒸餾水透析24 h，醇沉，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌3次，-20 ℃冷凍干燥至恒重，得白雪茶粗多糖樣品，置玻璃干燥器中備用。精密稱取白雪茶粗多糖樣品100.0 mg，按2.1 方法同法操作，測定吸光度。根據(jù)葡萄糖標準曲線計算出粗多糖樣品中多糖的質量分數(shù)。按公式：多糖提取率（%）=[多糖質量分數(shù)（%）×粗多糖樣品質量（g）/蜂花粉干重質量（g）]×100 計算多糖提取率。

2.3 白雪茶多糖提取的正交試驗

本實驗選擇提時間、提取溫度，料液比為觀察因素，采用L9（34）正交試驗表設計試驗（見表1），以多糖提取率為考察指標，篩選最佳提取條件。

表1 白雪茶多糖提取正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction Thamnolia vermicularis polysaccharide

2.4 白雪茶多糖對清除羥基自由基（·OH）的作用

[7-8]方法進行。將多糖樣品配制為0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mg/mL 質量濃度溶液，各取1.0 mL，分別加入9.0 mmol/L FeSO4、9.0 mmol/L水楊酸-乙醇各1.0 mL，對照組以蒸餾水1.0mL 代替多糖溶液。最后加8.8 mmol/L H2O2啟動反應，37 ℃水浴反應0.5 h 后，以蒸餾水調(diào)零，在波長510 nm 下測定吸光度。為扣除多糖溶液本身可能產(chǎn)生的吸光值，以不加H2O2的多糖溶液作為本底管。以VC作陽性對照品，臨用前用蒸餾水配制成與多糖溶液相同的質量濃度。同法操作，進行對照試驗。每個質量濃度做3 個平行管，結果取平均值。按清除率（%）=[（A0-Ax-Ax0）/A0]×100 計算清除率。式中：A0為對照組吸光度值，Ax為多糖樣品吸光度值，Ax0為本底管吸光度值。

2.5 白雪茶多糖對清除超氧陰離子自由基的作用

采用鄰苯三酚自氧化法進行測定[9-10]。多糖樣品配制同2.4。取pH8.2 的Tris-HCl 緩沖液0.50 mL 于具塞試管，加不同質量濃度的多糖液1.0 mL 置25 ℃水浴保溫20 min 后，再加入在25 ℃預熱的5.0 mmol/L 鄰苯三酚溶液0.5 mL，混勻后25 ℃水浴4 min，快速搖勻，在325 nm 處，以pH 8.2 的Tris-HCl 緩沖液調(diào)零，每隔30 s 測定1 次吸光度，連續(xù)測定4min，計算加入多糖樣品后的自氧化速率△Ax。自氧化速率=（最后1次測定值-第1 次測定值）/4?？瞻讓φ战M以1.0 mL 蒸餾水溶液代替多糖樣品，同法操作，測定自氧化速率△A0。同法以VC作為陽性對照試驗。按公式：清除率（%）=[（△A0-△Ax）/△A0]×100 計算清除率。

3 實驗結果

3.1 標準曲線的繪制

以吸光度為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算出回歸方程為：A=0.006C-0.005，R2=0.998 2，表明葡萄糖質量濃度在10 μg/mL～80 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度值有較好的線性關系。

3.2 白雪茶多糖提取正交試驗結果

白雪茶多糖提取正交試驗結果見表2、表3。

表2 白雪茶多糖提取正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiments for extraction Thamnolia vermicularis polysaccharide

表3 白雪茶多糖提取正交試驗方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments for extraction Thamnolia vermicularis polysaccharide

由表2 可直觀看出，正交試驗極差R 的大小順序為RB＞RA＞RC，即對多糖提取率的影響依次為提取溫度＞提取時間＞料液比。方差分析表明，提取溫度、提取時間對提取率的影響有顯著性差異（P＜0.05），而料液比影響較?。≒＞0.05）?？紤]到后續(xù)減壓濃縮等因素，料液比不宜過大，故本實驗選擇白雪茶多糖的最佳提取條件為A3B3C2，即提取溫度為80 ℃，浸提時間為12 h，料液比為1∶15。為進一步驗證A3B3C2提取條件，本實驗按此工藝對白雪茶多糖提取進行了3 組平行試驗，結果表明，3 次試驗的多糖提取率分別為2.605 %、2.614%、2.607%，平均提取率2.609%（RSD=1.48%）。表明A3B3C2工藝組合穩(wěn)定可行。

3.3 白雪茶多糖對清除羥基自由基（·OH）的作用

白雪茶多糖對清除羥基自由基（·OH）的作用結果，見圖1。

圖1 不同質量濃度白雪茶多糖和VC對·OH 的清除率Fig.1 Different mass concentration of Thamnolia vermicularis polysaccharide and vitamin C on the effect of scavenging hydroxyl free radical

結果表明，在質量濃度低于0.30 mg/mL 時，多糖清除·OH 的作用較小，而質量濃度從0.30 mg/mL 增加到0.40 mg/mL 時，清除率從11.02 %迅速升高至36.56%。表明雪茶多糖對清除·OH 的作用有劑量依賴關系，在40.0 mg/mL～0.60 mg/mL 劑量范圍內(nèi)，表現(xiàn)出一定的劑量效應關系。

圖2 不同質量濃度白雪茶多糖和VC對·的清除率Fig.2 Different mass concentration of Thamnolia vermicularis polysaccharide and vitamin C on the effect of scavenging superoxide anion free radical

4 討論

參考文獻：

[1]江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典：上冊[M].上海：上海人民出版社,1986：992-994

[2]魏桂芳,徐磊,姚宏.紅花的鑒定標準與藥理研究[J].陜西中醫(yī),2010,31(6)：376-377

[3]朱欣婷,植物多糖的生物活性研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2008,36(28)：12076-12077

[4]董莎莎,左紹遠.花粉多糖抗腫瘤作用機理研究進展[J].中國民族民間醫(yī)藥,2009,18(3)：29-30

[5]張丙燦,左紹遠,董莎莎.雪茶多糖對免疫功能的影響[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2010,6(3)：11-13

[6]張惟杰.糖復合物生化研究技術[M].杭州：浙江大學出版社,1999：13-14

[7]Smimorff N,Cumbes Q J.Hyroxyl radical scavenging activity of compatible solutes[J].Phytochemistry,1989,28(4)：1057-1060

[8]王德才,高麗君,高艷霞.泰山四葉參多糖體外抗氧化活性的研究[J].中國生化藥物雜志,2008,29(2)：104-106

[9]范三紅,周立波.油松花粉多糖提取及其清除羥自由基活性研究[J].食品科學,2009,29(12)：274-277

[10]張澤慶,田應娟,張靜.防風多糖的抗氧化活性研究[J].中藥材,2008,31(2)：268-269