林 強(qiáng)，冉曉瀟，趙 軍，劉應(yīng)雄，柳成益，韓 燈

(1.四川林業(yè)科學(xué)研究院，四川 成都 610081;2.攀枝花市林業(yè)局，四川 攀枝花;617000，3.攀枝花市農(nóng)林科學(xué)院，四川 攀枝花 617065;4.北川縣林業(yè)局，四川 北川 622750;5.松潘縣林業(yè)局，四川 松潘縣 623302)

塊菌(Truffle)，屬子囊菌亞門(Ascomycotina)，塊菌目(Tuberales)，塊菌科(Tuberaceae)，塊菌屬(Tuber Micheli :F.H.Wigg.)。歐洲常見的塊菌種類60余種，商業(yè)塊菌的種類，主要是黑孢塊菌，夏塊菌和意大利白塊菌。商業(yè)的塊菌素有“黑鉆石”之稱，是食用菌中最珍稀的種類，鮮塊菌價格在歐洲市場500 歐元·kg－1～1 500歐元·kg－1。

1 材料和方法

本研究供試材料黑孢塊菌(Tuber melanosporum)，夏塊菌(Tuber aestivum)由意大利皮埃蒙特大區(qū)IPLA 林業(yè)環(huán)境研究所提供。

1.1 種質(zhì)資源和生態(tài)學(xué)屬性

黑孢塊菌(Tuber melanosporum)分布在法國、意大利、西班牙等歐洲國家，目前引種到加拿大、美國、澳大利亞、新西蘭等國家已經(jīng)獲得栽培成功。直徑5 cm～15 cm 不等，重量從數(shù)十克到1 kg。與中國的印度塊菌形態(tài)特征和遺傳特征都十分相似。宿主植物有:歐洲櫟、歐洲榛子、雪松、榆樹、山毛櫸等多種植物。我們同樣也在云南松、滇榛、板栗上成功接種了黑孢塊菌。生長土壤要求含鈣質(zhì)較高，pH 值7.5～8.5 范圍，冬季平均溫度1℃～8℃，夏季平均溫度17.5℃～22.5℃，年平均降雨量600 mm～1 500 mm 出產(chǎn)季節(jié)，從頭年10月到次年3月。

夏塊菌(Tuber aestivum)分布在法國、意大利、西班牙等歐洲國家，我國攀西地區(qū)會東縣也發(fā)現(xiàn)有夏塊菌分布。目前引種到澳大利亞、新西蘭等栽培獲得成功。直徑2 cm～10 cm，重量可以達(dá)到幾十克到幾百克。在晚夏和早秋成熟，生長溫度與黑孢塊菌類似，土壤pH 值6.5～8.5。分布接近土表。宿主植物主要有:歐洲榛子、歐洲櫟。我們也在云南松、滇榛、板栗上接種獲得成功(參見圖1)。

圖1 歐洲黑孢塊菌(左)及夏塊菌(右)

1.2 宿主植物云南松無菌苗培育

收集優(yōu)質(zhì)的云南松母樹園種子用水選法去除空殼種子，用0.1%的高錳酸鉀液浸泡處理30 min，用自來水沖洗去表面殘留的高錳酸鉀溶液，然后再用清水浸泡1 d～2 d，在這期間換一次清水。將表面滅菌處理后的云南松種子播人混合基質(zhì)的培育箱中，培養(yǎng)基質(zhì)為蛭石與珍珠巖的混合物，其體積比為蛭石∶珍珠巖∶泥炭土為1∶1∶1，在121℃～126℃的高壓滅菌器下滅菌2.5 h～3 h 放置一周后使用。播種后，用清水將基質(zhì)澆透后放置于室內(nèi)催芽，待80%以上的種子發(fā)芽后再移入煉苗室內(nèi)進(jìn)行無菌苗培育，需注意的是溫度要保持在10℃～30℃之間，基質(zhì)的濕度保持在50%～70%。云南松無菌苗培育3月以上，根部開始木質(zhì)化后即可進(jìn)行接種。

1.3 宿主植物接種方法

1.3.1 菌劑的配制方法

將供試的和黑孢塊菌及夏塊菌分別在碾缽內(nèi)磨成粉狀，粉狀菌種按1∶1的比例和細(xì)沙混合即為接種的菌劑，菌劑要隨用隨配，用不完的需要在冰箱2℃～5℃環(huán)境冷藏保存。

1.3.2 接種

將培育好的云南松無菌苗浸泡在自來水里至根部基質(zhì)松解，在適宜的容器內(nèi)裝入上述培滅菌基質(zhì)，至2/3 深度，然后用小勺舀一勺約3 g 上述菌劑，在容器基質(zhì)表面，將云南松無菌苗栽入，使根部與菌劑接觸，然后覆蓋基質(zhì)壓緊，用水澆透，將接種苗放置在煉苗室培育半月，期間適當(dāng)澆水，然后移到溫室大棚育苗架上培養(yǎng)6個月。

1.4 檢測方法

采用OLYMPUS SZ61Q 體式顯微鏡篩選感染須根，BX41 顯微鏡觀測微觀特征。囊狀體即晶狀附屬物，鞘狀細(xì)胞。

隨機(jī)選擇培育6個月齡云南松接種苗，在玻璃缽內(nèi)浸泡1 h，用自來水沖洗干凈，注意勿傷根部。檢測:在解破鏡下，先觀測接種植物根部，通常感染發(fā)生在須根上，確認(rèn)有感染征兆，再用鑷子捏取或用解剖刀切取，感染部位。將切取材料在載玻片上放下，滴一滴清水，蓋上蓋玻片，擠壓蓋玻片，然后在顯微鏡下檢測。

2 結(jié)果與分析

感染的典型的宏觀特征，棒狀的須根，二叉分枝，或則珊瑚狀分枝;顯微特征，隨不同的塊菌會不一樣，一些在菌根表面的翹呈不規(guī)則的網(wǎng)格例如夏塊菌，一些呈馬賽克似的拼圖，初期在菌根的表面還會出現(xiàn)囊狀體－長長的絲狀不分割的有點類似菌絲的附屬物，菌根顏色初期為淺肉色，老時變黑，通常具有明顯的蒼白色的頂部，所有這些是檢測的客觀的標(biāo)準(zhǔn)(參見圖2)。

圖2 感染夏塊菌菌根的宏觀特征二叉、珊瑚狀分枝及囊狀體

用OLYMPUS BX41 光學(xué)顯微鏡檢測。經(jīng)檢測可清晰的看到菌根表面的囊狀體。囊狀體著生在菌根表面，且不分支，較堅硬，囊狀體基部細(xì)胞較大。菌絲是從根系表皮細(xì)胞間隙向皮層伸展，并在皮層細(xì)胞之間交織成網(wǎng)狀。菌根表面未發(fā)現(xiàn)菌索和菌核。菌根橫切面上能觀察到哈蒂氏網(wǎng)(Hartig net)結(jié)構(gòu)，野外菌根可清晰看到菌絲在營養(yǎng)根表繁殖，層層交織形成的菌套呈暗褐色或黑色，而根組織細(xì)胞清晰可見，呈淺褐色或褐色，塊菌菌根具有囊狀體及獨特的菌套結(jié)構(gòu)，這是塊菌屬菌根的顯著特征。未形成菌根的營養(yǎng)根橫切片，可見小而排列緊密的表皮細(xì)胞，其顏色與其它細(xì)胞無區(qū)別，均呈淺褐色或褐色。與苗圃中的菌根苗菌根觀察效果有差別的是，菌根周圍有雜菌侵染的情況，菌套顏色要深得多，與天然林中塊菌接種后形態(tài)類似(參見圖3，圖4 和圖5)。

圖3 夏塊菌感染苗須根表面特征

3 結(jié)論和討論

云南松無菌苗的培育要嚴(yán)格遵從無菌操作技術(shù)，否則會造成嚴(yán)重的污染。采用孢子粉菌劑接種宿主植物，感染率極高，通常接種后半年可以觀測到感染結(jié)果，這個是歐洲常規(guī)的塊菌接種方法。

圖4 黑孢塊菌菌根形態(tài)

圖5 黑孢塊菌鞘狀細(xì)胞

塊菌菌根宏觀上無論夏塊菌還是黑孢塊菌區(qū)別不大，甚至和大多數(shù)的其它菌根真菌很類似。但是微觀特征有著明顯的區(qū)別。第一塊菌菌根感染初期，有不分割的絲狀的囊狀體細(xì)胞，第二夏塊菌的鞘狀細(xì)胞是不規(guī)則的網(wǎng)格狀，而黑孢塊菌則是不規(guī)則的多角形，有點類似馬賽克花紋與印度塊菌的花紋極為相似。

菌根微觀顯微特征是鑒別不同種塊菌菌根的關(guān)鍵特征，形態(tài)學(xué)的特征檢測，是歐洲最常用的菌根檢測技術(shù)，進(jìn)一步還可以采用DNA 指紋圖譜技術(shù)鑒定感染的菌根塊菌種類，特別是區(qū)分印度塊菌和黑孢塊菌需要分子生物學(xué)的分析手段。