陶 然，任國慧，房經貴，李曉鵬，李阿英

(南京農業(yè)大學園藝學院，江蘇南京210095)

香氣在果實品質構成中是一項重要的經濟性狀，多樣的香氣成分使果實具備了不同的風味特點［1］。果樹是大田與經濟作物中以果實為直接食用部分的主要作物種類，果實中富含的香味成分決定了其特有的食用價值［2］。葡萄(Vitis vinifera Linn.)素有“水果皇后”的美稱，是一種加工產品頗為豐富的水果，在世界果樹栽培中屬于種植面積較大的果樹樹種［3］。目前從葡萄果實中已鑒定出800 多種芳香成分［4］，一些低分子量的揮發(fā)性萜類化合物(如單萜和倍半萜等)還是許多鮮食和釀酒葡萄品種特有的風味和香氣成分［5-7］。有關葡萄果實芳香成分的研究［8-9］較多。近年來，隨著植物代謝工程的興起，許多果實風味成分的生物合成途徑及其相關酶的重要性逐漸明晰。葡萄全基因組測序的結果表明:葡萄所包含的“制造”香氣中萜類化合物的“香味基因”數(shù)目是已經完成基因組測序的其他植物的2 倍［10］。這些研究結果都為在分子水平上對葡萄香氣成分的合成以及葡萄品質的改良提供了有益的參考與新的思路。

萜類化合物屬植物次生代謝產物，因其種類繁多、結構多樣，被認為是自然界中最大的一類復合物家族，由4 萬多種成分組成［11］。在果實香氣成分合成的三大主要途徑中，萜類合成途徑就是其中之一［12］。萜類合酶(terpenoid synthase，TPS)是萜類化合物合成的直接催化者，也是萜類生物合成中研究較多的一類關鍵酶，統(tǒng)稱為TPS 家族。按形成產物的不同，TPS 家族酶可分為單萜合酶、倍半萜合酶和二萜合酶等，它們分別以牻牛兒基焦磷酸(geranyl diphosphate，GPP)、橙花基焦磷酸(neryl diphosphate，NPP)、法呢基焦磷酸(farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP)和牻牛兒酰牻牛兒基焦磷酸(geranylgeranyl diphosphate，GGPP)為直接前體底物合成相應的單萜、倍半萜和二萜成分［13］。此外，一些萜類合酶的構成特性使其可催化單一底物產生多個萜類產物，因此很多TPS 都以主產物命名［14］。Martin 等［15］從葡萄品種‘瓊瑤漿’(‘Gewürztraminer’)和‘黑比諾’(‘Pinot noir’)中分別克隆得到了 3 個(VvGwECar1、VvGwECar2 和VvGwECar3)和 2 個(VvPNECar1 和 VvPNECar2)萜類合酶家族基因，大腸桿菌體外表達結果顯示它們編碼的酶生成的主要產物都為(-)-丁香烯，與此同時也不同程度地產生了部分α-葎草烯和香葉烯D，因而這5 個基因編碼的酶均被稱為(E)-β-丁香烯合酶。目前，在葡萄果實發(fā)育時期有關(E)-β-丁香烯合酶基因調控表達方面的研究尚未見報道。

為了對葡萄(E)-β-丁香烯合酶基因有進一步認識，作者以歐美雜種中具有典型香味的釀酒葡萄品種‘德引84-1’(‘Deyin 84-1’)為實驗材料，成功分離出 (E)- β - 丁 香 烯 合 酶 〔(E)-β-caryophyllene synthase〕基因，并統(tǒng)一命名為Vv-ECar，在比較其序列特征的基礎上對葡萄果實發(fā)育時期Vv-ECar 的半定量和定量表達進行了分析，以期為葡萄果實中萜類成分的調控機制研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 電子克隆

以與編碼葡萄倍半萜合酶基因同源性較高的EST 序列(序列號 EC953713.1)作為探針，對葡萄屬(Vitis Linn.)EST 數(shù)據庫進行 BLAST 檢索，得到多條與之高度同源的葡萄EST 序列。將獲得的EST 序列用DNAMAN 軟件進行首尾拼接，獲得新的Contig，將獲得的 Contig 反復對葡萄 EST 公共數(shù)據庫進行BLAST 檢索及拼接，直到沒有新的EST 序列可供拼接為止。最終拼接得到的目的基因可能的全長cDNA序列長度為1 843 bp。

1.2 實驗克隆

1.2.1 材料 供試材料為釀酒葡萄品種‘德引84-1’，于2011 年采自中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所;分別于葡萄盛花后20、40、60 和80 d(即果實發(fā)育的幼果期、膨大期、轉色期和成熟期)，從標記植株的東、西、南、北4 個方向各選1 ～2 穗果，從每穗果的上、中、下、里、外各方位取大小一致的果實4 ～5 粒，其中幼果期采果約100 粒，其他時期各采果約50 粒;所有樣品采集后立即投入液氮并帶回實驗室將種子剔除(處于幼果期的果實較小，無法剔除種子)，然后將樣品全部貯存于-70 ℃用于總RNA 的提取。

大腸桿菌菌株DH5α 由作者所在實驗室保存。PowerScript ⅡTM反轉錄酶購自美國 Clontech 公司;DNaseⅠ酶、LA Taq 酶、Ex Taq 酶、pMD18-T Simple 載體、dNTP 和DNA Marker 均購自寶生物工程(大連)有限公司;TrizolR○Reagent 購自美國Invitrogen 生命技術公司;熒光定量染料SYBR GreenⅠ購自東洋紡(上海)生物科技有限公司;DNA 回收試劑盒及DL2000 Plus DNA Marker 由北京全式金生物技術有限公司生產;PloyA TtractR○mRNA Isolation System Ⅳ試劑盒由美國Promega 公司生產。所用的10 個引物由上海英駿生物技術有限公司合成，其序列及用途見表1。

表1 用于葡萄果實Vv－ECar 基因克隆的引物序列及用途Table 1 Sequence and use of primers used for cloning of Vv－ECar gene of Vitis vinifera Linn. fruit

1.2.2 RNA 提取與純化 采用改良 CTAB 法［16-17］提取葡萄果實總RNA;采用PloyA TtractR○mRNA Isolation System Ⅳ試劑盒進行mRNA 的純化。

1.2.3 cDNA 合成 以葡萄 mRNA 為模板，用引物P01 反轉錄合成cDNA 第1 條鏈，用引物P02 延伸加帽子，在空氣加熱條件下于42 ℃保溫1 h、75 ℃保溫10 min，于冰上冷卻2 min 后置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2. 4 基因開放閱讀框( ORF) 的擴增 以上述cDNA 為模板用引物P03 和P04 進行PCR 擴增，反應體系總體積 50 μL，包含 cDNA 2.0 μL、10 μmol·L-1引物各 2.0 μL、5 U·μL-1Ex Taq 酶 0. 50 μL、10×PCR buffer(Mg2+plus)5.0 μL、2. 5 mmol·L-1dNTP Mixture 4. 0 μL 和雙蒸水 34. 5 μL。擴增程序為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s、55 ℃退火45 s、72 ℃ 延伸90 s，共35 個循環(huán);最終于72 ℃ 延伸5 min。用質量體積分數(shù)1.0%瓊脂糖凝膠對獲得的PCR 擴增產物進行電泳，切下目的片段并用DNA 凝膠回收試劑盒回收目標片段并進行TA 克隆，DNA 測序由上海博亞生物技術有限公司完成。

1.2.5 基因3'末端 PCR 擴增 以上述 cDNA 為模板用引物P05 和P06 進行PCR 擴增獲得基因的3'末端(3'UTR 區(qū))。反應體系總體積25 μL，包含 cDNA 1.0 μL、引物各1.0 μL、5 U·μL-1Ex Taq 酶0.15 μL、10×PCR buffer(Mg2+plus)2.5 μL、2.5 mmol·L-1dNTP Mixture 2.0 μL 和雙蒸水 17.35 μL。擴增程序為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性40 s、54 ℃退火40 s、72 ℃延伸40 s，35 個循環(huán);最后于72 ℃延伸 10 min。用質量體積分數(shù)2.0%瓊脂糖凝膠對獲得的PCR 擴增產物進行電泳檢測，然后用DNA 回收試劑盒回收目標片段并進行TA 克隆，DNA 測序由上海博亞生物技術有限公司完成。

1.2.6 生物信息學分析 利用DNAMAN 軟件對Vv-ECar 的ORF、3'末端序列進行拼接分析;并分別利用NCBI 的 BLASTn 和 BLASTp(http:∥blast. ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)將基因的核苷酸序列和氨基酸序列與茶〔Camellia sinensis (Linn.)O. Kuntze〕、毛果楊(Populus trichocarpa Torr. et A. Gray)、美味獼猴桃(Actinidia deliciosa C. F. Liang et A. R. Ferguso)、箭葉 橙 (Citrus hystrix DC.)、楊 (Populus balsamifera subsp. trichocarpa×P. deltoids)和香椿〔Toona sinensis(A. Juss.)Roem.〕的相應序列進行相似性分析。

1.3 Vv－ECar 基因的表達分析

從不同時期果實中提取總 RNA，用DNaseⅠ酶(RNase free)消化和 CHCl3抽提，然后分別取2 μg，用引物P01 逆轉錄合成的cDNA 為模板，采用Primer-BLAST(http:∥www. ncbi. nlm. nih. gov/tools/primerblast)設計的引物P09 和P10 進行半定量RT-PCR 和熒光定量PCR 分析，以確定Vv-ECar 在果實發(fā)育時期相對表達水平的變化。為確保半定量RT-PCR 和熒光定量PCR 的特異性，引物P09 和P10 被設計在Vv-ECar 基因的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)，內參基因是利用葡萄UBI 的特異性引物P07 和P08 擴增獲得的長度為141 bp 的基因片段。定量RCR 反應在Rotor-Gene 熒光定量 PCR 儀上進行，實驗體系設置參照SYBR GreenⅠ說明書，每個樣品重復檢測3 次。實驗數(shù)據采用 Lin-RegPCR［18］和 Excel 2003 軟件進行分析。

2 結果和分析

2.1 葡萄果實 Vv－ECar 基因的克隆

根據電子克隆的Vv-ECar 的cDNA 全長設計簡并引物P03 和P04，以葡萄品種‘德引84-1’果肉總RNA 逆轉錄的cDNA 第1 鏈為模板，擴增獲得長度為1 674 bp 的全長開放閱讀框ORF(圖1-A)。利用引物P05 和P06 進行3'RACE 克隆，得到長度為209 bp的3'末端(圖1-B)，將引物3'端和ORF 全長拼接獲得 Vv-ECar 基因 cDNA，全長為1 880 bp。Vv-ECar 的全長序列包括長度為1 674 bp 的ORF、209 bp 的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)以及28 bp 的poly+(A)，經推導其氨基酸序列含有557 個氨基酸。該基因的GenBank 登錄號為JF808010。

圖1 葡萄果實Vv－ECar 基因的PCR 擴增結果Fig. 1 PCR amplification result of Vv-ECar gene of Vitis vinifera Linn. fruit

2.2 葡萄果實Vv－ECar 基因的序列分析

利用DNAMAN 將克隆獲得的Vv-ECar 編碼區(qū)序列與Martin 等［15］在葡萄品種‘瓊瑤漿’和‘黑比諾’中已克隆得到的 VvGwECar1、VvGwECar2、VvGwECar3、VvPNECar1 和 VvPNECar2 等 5 個(E)-β-丁香烯合酶基因編碼區(qū)序列進行比對，發(fā)現(xiàn) Vv - ECar 與VvGwECar2 同源性最高，可達93%，與其他4 個基因的同源性也都在60% 以上。該序列的編碼區(qū)與VvGwECar2 的編碼區(qū)序列長度相同，都為1 674 bp，其中存在110 個堿基替換，包括30 個顛換和80 個轉換。比對結果也表明:這2 個序列編碼的氨基酸序列同源性也高達90.8%，氨基酸殘基僅在51 個位點上有差異;此外，2 個氨基酸序列都從第310 位至第314位具有植物萜類合酶家族共有的1 個天冬氨酸富集基序(DDXXD)。因此可初步推斷在本研究中克隆獲得的基因為(E)-β-丁香烯合酶基因。

同源性比對結果顯示:葡萄Vv-ECar 基因的核苷酸序列與茶(JQ247185.1)、毛果楊(JF449450.1)、美味獼猴桃(AY789791.1)、箭葉橙(HQ652871.1)、楊(AY438099.1)、香椿(AB509224.1)等植物的萜類合酶基因的序列同源性高達70%以上，其中與茶和楊的序列同源性高達73%。從進化樹(圖2)上也可看出:葡萄品種‘德引84-1’果實Vv-ECar 基因所編碼的氨基酸序列與其他植物同源基因編碼的氨基酸序列具有高度保守性。

2.3 葡萄果實發(fā)育期Vv－ECar 基因的表達分析

分別采用半定量RT-PCR 和熒光定量PCR 對葡萄果實發(fā)育期Vv-ECar 基因的表達狀況進行分析，結果見圖3。分析結果表明:采用熒光定量PCR 檢測的葡萄果實發(fā)育期Vv-ECar 基因的相對表達量與半定量RT-PCR 結果一致。總體上看，在幼果期Vv-ECar表達最強，伴隨果實的不斷發(fā)育相對表達量逐漸下降，在果實成熟期時相對表達量又明顯上升。

圖2 葡萄果實Vv－ECar 基因與其他植物同源基因編碼的氨基酸序列的分子進化樹Fig. 2 Molecular phylogenetic tree of amino acid sequences encoded by Vv-ECar gene from Vitis vinifera Linn. fruit and homologous genes from other plants

圖3 葡萄果實不同發(fā)育時期Vv－ECar 基因表達的半定量RT－PCR和定量PCR 分析結果Fig. 3 Analysis results of semi-quantitative RT-PCR and quantitative PCR of Vv-ECar gene expression during different development stages of Vitis vinifera Linn. fruit

3 討 論

葡萄果實香氣是構成葡萄酒香氣的重要組分之一，與發(fā)酵香和陳釀香共同構成了葡萄酒的香氣和風格［19］。作者利用生物信息學方法同源克隆獲得了與葡萄香氣品質相關的(E)-β-丁香烯合酶基因Vv-ECar，該基因的核苷酸序列與 Martin 等［15］在葡萄品種‘瓊瑤漿’和‘黑比諾’果實中克隆獲得的5 個基因具有較高的同源性，與來源于茶、毛果楊、美味獼猴桃、箭葉橙、楊和香椿的萜類合酶的相關基因的同源性也較高，此外，葡萄Vv-ECar 基因編碼的氨基酸具有萜類合酶家族的共有基序，因此可推斷本研究克隆獲得的cDNA 序列是葡萄Vv-ECar 基因。

萜類化合物種類繁多，是植物次生代謝物中種類最多的一類，更是特有香氣組成的重要成分之一。通常萜類化合物的積累始于果實變色期，且隨著葡萄果實的成熟總體含量逐漸上升，在葡萄果實過度成熟時萜類化合物含量最高［20］。葡萄果實發(fā)育過程中香氣成分含量的變化主要集中于轉色期到成熟期［21-22］。而作者的研究結果顯示:葡萄Vv-ECar 基因在果實發(fā)育初期表達最強，隨后逐漸減弱，在成熟期時該基因表達又明顯增強。Lücker 等［23］的研究結果表明:葡萄種子特別是幼小種子中含有較多的萜類合酶，而在種子其后的發(fā)育過程中幾乎無萜類合酶基因的表達，且處于發(fā)育階段的果實(包括種子在內)中萜類合酶基因的表達都十分微弱。在本研究中，葡萄幼果期Vv-ECar 基因相對表達水平最高，也可能與幼果中含有幼嫩種子有關。Wilson 等［24］認為:在熟透的麝香葡萄(Vitis vinifera‘Muscat Hamburg’)中，萜類化合物的含量隨著果實中糖分和一些單萜類化合物的積累達到峰值。作者認為葡萄果實成熟期萜類化合物含量較高，與葡萄果實發(fā)育后期Vv-ECar 基因表達量的明顯上升有關。

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