張培，惠嫣婷，潘蘭兵，劉若余

(貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025)

豬應(yīng)激綜合癥(Porcine Stress Syndrome，PSS)是豬在非特異性因子(運輸、高溫、合群等)作用下，發(fā)生的惡性高熱(體溫驟升至42～45℃)、呼吸急促、心跳過速、肌肉強直、后肢呈現(xiàn)痙攣性收縮、突然死亡、肉質(zhì)變劣等征候群。PSS 易導(dǎo)致部分豬因應(yīng)激而產(chǎn)生PSE 肉甚至死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。據(jù)研究，PSS 主要受常染色體上隱性基因(Haln)控制，隱性純合體表現(xiàn)對氟烷麻醉敏感，因而稱為氟烷基因。Knudson等認為，蘭尼啶受體(Rynodine Receptor，RYR1)基因是氟烷基因的主要候選基因［1］，RYR1基因cDNA中C1843→T1843堿基變異使氨基酸序列中第615位處的精氨酸變?yōu)殡装彼幔?］，引起蘭尼啶受體發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的改變，導(dǎo)致在應(yīng)激狀態(tài)下肌肉組織中Ca2+大量非正常釋放，引起豬出現(xiàn)PSS［3－4］。研究顯示，C1843→T1843變異導(dǎo)致了HhaI 酶切位點(5’GCG↓C3’，HalN)的改變，從而使正常豬和應(yīng)激敏感豬RYR1基因的酶切片段出現(xiàn)多態(tài)，因此，目前多利用聚合酶鏈式－限制性片段長度多態(tài)性(PCR－RFLP)技術(shù)對該基因進行檢測。

可樂豬是國家級保護的優(yōu)良地方品種，主產(chǎn)于貴州省畢節(jié)市的喀斯特高寒山區(qū)，耐粗飼，抗逆性強，并且肉質(zhì)優(yōu)良，肉味鮮美，在部分肉質(zhì)指標上優(yōu)于香豬［3］，是云南宣威火腿和威寧火腿的主要加工原材料。為開發(fā)利用可樂豬的優(yōu)良種質(zhì)特性，本文采用PCR－RFLP 技術(shù)對可樂豬的氟烷基因進行檢測，以了解氟烷基因在可樂豬群體中的分布情況，為可樂豬的保種、選育和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗所用的45份可樂豬耳組織樣均采自畢節(jié)地區(qū)可樂豬保種場。用耳號鉗取豬耳緣組織，浸泡于75%酒精溶液中，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取采用酚－氯仿抽提法提取豬基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計與PCR 反應(yīng)參照文獻［5］中的引物序列，上游引物F 5’TCCAGTTTGCCACAGGTCGTACCA3’和下游引物 R 5’ATTCACCGGAGTTTAGTCTCTGA3’由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR 反應(yīng)體系:上、下游引物(10 pmol/μL)各1.5μL，DNA 模板2μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，加ddH2O 至25μL;反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃4 min→(變性94℃50 s→退火58.2℃45 s→延伸72℃50 s)35個循環(huán)→延伸72℃10 min。PCR 產(chǎn)物利用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.3 RFLP 分析酶切總反應(yīng)體系20μL:PCR產(chǎn)物8μL ，限制性內(nèi)切酶HhaI 1.5μL(10U/μL)，緩沖液M 3μL，ddH2O 7.5μL ，37℃恒溫過夜。酶切產(chǎn)物用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。

1.2.4 測序分析在進行RFLP 檢測分離出不同基因型個體后，每種基因型隨機抽取3個樣本進行PCR 擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴增

經(jīng)過35個循環(huán)的PCR 擴增后，取出5μL的擴增產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示。從圖1可知，在659 bp 處出現(xiàn)單一的特異性條帶，與目的片段大小相符，可用于后續(xù)試驗。

圖1 RYR1基因PCR 擴增結(jié)果Fig.1 Amplification result of RYR1gene

2.2 RFLP 檢測

對擴增的PCR 產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶HhaI 進行消化，酶切結(jié)果用10%聚丙烯凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。從圖2可知，在45個可樂豬樣本中僅檢測出兩種基因型，沒有發(fā)生突變的HalNN型(片段大小為493 bp和166 bp)有41頭，有1個等位基因發(fā)生變異的HalNn型(片段大小為659 bp、493 bp和166 bp)個體有4頭。

圖2 RYR1基因的RFLP 檢測結(jié)果Fig.2 RFLP detection results of RYRl gene

2.3 測序結(jié)果

對已進行RFLP 檢測的不同基因型樣本進行測序驗證及序列比對，結(jié)果見圖3。測序結(jié)果顯示，兩種基因型個體在HhaI 酶切位點處發(fā)現(xiàn)了C→T的堿基變異，其中HalNN基因型個體僅出現(xiàn)了堿基C的單一峰，而HalNn基因型個體的測序結(jié)果中顯示出C/T的雜合峰，進一步證明了本研究中RFLP 檢測結(jié)果的可靠性。

圖3 不同基因型RYR1基因的測序檢測結(jié)果Fig.3 Sequencing results of RYR1 gene in different genotypes

2.4 RYR1基因的基因型頻率和基因頻率

根據(jù)PCR－RFLP 檢測結(jié)果判定基因型，并計算基因型頻率和基因頻率，如表1所示。由表1可知，RYR1基因的基因型頻率和基因頻率呈現(xiàn)偏態(tài)分布，HalNN基因型個體占多數(shù)為45頭，頻率為0.9111;而HalNn基因型個體較少為4頭，頻率為0.0889。因此，HalNN在可樂豬群體中為優(yōu)勢基因型。從基因頻率來看，等位基因HalN的頻率為0.9556，等位基因Haln的頻率為0.0444，HalN為優(yōu)勢等位基因。

表1 RYR1基因的基因型頻率和等位基因頻率Tab.1 Genotype frequencies and allele frequencies of RYR1 gene

2.5 RYR1基因的群體遺傳特性

對可樂豬RYR1基因的雜合度、多態(tài)信息含量等統(tǒng)計結(jié)果見表2。由表2可知，可樂豬RYR1基因的純合度較高，為0.9151;從多態(tài)信息含量來看，可樂豬處于低度多態(tài)(PIC＜0.25)。適合性檢驗表明，可樂豬RYR1基因頻率不符合期望比例(P＜0.05)，即可樂豬群體在該位點處偏離了Hardy－Weinberg 平衡。

表2 可樂豬RYR1基因的純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量和χ2值Tab.2 Homozygosity (Ho)，Heterozygosity(He)，Effective number of alleles(E)，Polymorphism Information Content(PIC)and Chi square(χ2)of RYR1 gene in Kele pigs

3 討論

本研究利用PCR－RFLP 技術(shù)對45頭可樂豬進行了氟烷基因檢測，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)隱性純合個體(Halnn)，僅檢測出4頭雜合體(HalNn)，這與學(xué)術(shù)界普遍認為的氟烷基因在中國地方豬種中只少量存在的觀點相似［6－7］。本研究中Haln的基因頻率為0.0444，大于朱鋒釗等報道的結(jié)果［8］，這可能是由于選取了不同的可樂豬群體所致。據(jù)報道，氟烷基因主要分布在國外的一些瘦肉型豬種中。研究顯示，德國、比利時長白以及皮特蘭陽性率較高，可達70～100%，而杜洛克、大白豬、約克夏和漢普夏陽性率較低，一般低于10%。本研究在可樂豬群體中未檢測出氟烷陽性個體，說明近年來對可樂豬的保種選育工作具有一定的成效。

氟烷基因?qū)ωi肉質(zhì)影響較大，但研究表明雜合個體在生長、胴體和繁殖性狀上優(yōu)于顯性純合體和隱性純合體［9］。因此，就目前市場需求來看，單純地剔除氟烷基因是不利的，應(yīng)充分利用雜合個體的優(yōu)勢。可以考慮通過合理的選種選配，提高可樂豬群體中雜合個體所占比例，以提高可樂豬的胴體品質(zhì)，同時避免隱性純合個體的產(chǎn)生，以控制豬應(yīng)激綜合癥導(dǎo)致的劣質(zhì)豬肉。

［1］KNUDSON C M，MICKELSON J R，LOUIS C F，et al.Distinct immunopeptide maps of the sarcoplasmic reticulum Ca2+release channel in malignant hypethermia［J］.J Biol Chem，1990，265(5):2421－2424.

［2］FUJII J，OTSU K，ZORATO F，et al.Identifaction of muation in porcine ryandine receptor associated with malignant hyperthermia［J］.Science，1991，253:448－451.

［3］STINCKENS A，VAN DEN MAAGDENBERG K，LUYTEN T.The RYR1 g.1843C＞T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3－g.3072G＞A mutation on muscle hypertrophy［J］.Anim Genet，2007，38(1):67－71.

［4］BALATSKIL V N，METLITSKAIA E N.DNA diagnosis of porcine stress syndrome and RYRI genotype association with viability of young pigs［J］.Tsitol Genet，2001，35(3):43－49.

［5］熊遠.豬生化及分子遺傳試驗導(dǎo)論［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1999:35.

［6］丁能水，黃路生，任軍，等.江西省主要外來豬種氟烷基因分布頻率的初步研究［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1999，21(4):555－557.

［7］劉銳，郁輝.嘉興黑豬氟烷基因頻率檢測初報［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(18):5442－5442.

［8］朱鋒釗，楊春苗，樊翠華，等.七個貴州地方豬種RYR1基因突變的分布［J］.畜牧與獸醫(yī)，2009，41(4):52－55.

［9］杜曉婷，劉銳，張水明，等.PCR－RFLP 技術(shù)檢測嘉興鳳橋種豬氟烷基因［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(24):11437－11438.