梁婷婷，周英，2*，林冰，2，俸婷婷，2，劉雄利，2，王慧娟，2

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025;2.貴州省中藥(民族藥)創(chuàng)制工程中心，貴州貴陽 550025)

太子參別名孩兒參、童參、雙批七、四葉參或米參?！吨腥A人民共和國藥典2010年版》規(guī)定，太子參的原植物為石竹科植物異葉假繁縷Pseudostellaria heterophylla (Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.。太子參以塊根入藥，是一種珍貴的常用中藥材，有補(bǔ)氣健脾、生津潤肺、養(yǎng)陰益血之功效。其藥性平和，益氣養(yǎng)陰，可作為人參乃至西洋參的代用品，老少皆宜服用［1］?，F(xiàn)代研究證明，太子參含皂苷、多糖、揮發(fā)油、脂肪酸、油酯、甾醇、磷脂、氨基酸、微量元素等多種化學(xué)成分。其中，多糖具有增強(qiáng)肌體作用及免疫促進(jìn)等作用，是太子參的有效成分之一［2］。本文旨在探討其有效成分在太子參多糖提取過程中顯著影響的因素，通過正交試驗(yàn)確定其最佳提取工藝參數(shù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料太子參由貴州百靈集團(tuán)太子參種植基地提供，經(jīng)貴州大學(xué)熊源新教授鑒定為石竹科植物的干燥塊根。

試劑:葡萄糖(成都金山化學(xué)試劑有限公司，20100702);苯酚(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司，20100912);濃硫酸(重慶川東化工集團(tuán)有限公司，20110601);無水乙醇(重慶川東化工集團(tuán)有限公司，20111201);蒸餾水。所用試劑均為分析純。

1.1.2 試驗(yàn)儀器中藥粉碎機(jī)(環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司HY－0413);紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司TU－1901);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠RE－3000A);恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋(國華電器有限公司HH－2);冷凍干燥機(jī)(北京松源華興生物技術(shù)有限公司LGJ－10);鼓風(fēng)干燥機(jī)(上海一恒科技有限公司DHG);電子天平(上海光學(xué)儀器一廠FA2104)。

1.2 方法

1.2.1 太子參多糖樣品準(zhǔn)備太子參藥材放入50℃恒溫干燥箱中干燥48 h，取出，粉碎，過二號(hào)藥典篩，放入干燥器中備用。稱取太子參粉末30 g，加入適量溶劑，設(shè)定溫度、料液比、提取次數(shù)、提取時(shí)間，合并濾液，濃縮至每毫升藥液含太子參生藥1.0 g，加入乙醇至終濃度為80%，靜置，冷凍干燥即得太子參多糖。由于高溫干燥時(shí)得到的多糖為紅褐色粉末，并有焦糖味，冷凍干燥則得到無味的白色粉末，所以選擇冷凍干燥。

1.2.2 苯酚硫酸法測(cè)定太子參多糖含量

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的制備:精密稱取于105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，定容至100 mL 容量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

測(cè)定波長的選擇:精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.6 mL，置10 mL 具塞試管中，加入蒸餾水使終體積為2.0 mL，另取2.0 mL 蒸餾水作空白對(duì)照，各加5%苯酚試液1 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸各5 mL，搖勻后室溫放置30 min，在300～700 nm 波長范圍測(cè)定絡(luò)合物的吸光度。由于絡(luò)合物于490 nm 波長處有最大吸收，故測(cè)定時(shí)選用此波長。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密稱取于105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，定容至100 mL 容量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 置6只10 mL 具塞試管中，依次加入蒸餾水使終體積為2.0 mL，另取2.0 mL 蒸餾水作空白對(duì)照，各管加入5%苯酚試液1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸各5 mL，搖勻后室溫放置30 min，于490 nm 處測(cè)定吸光度［3］。以濃度C 為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=53.717 C +0.0175(R2=0.9991)，表明在0.004～0.024 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，葡萄糖的質(zhì)量濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

提取物中多糖含量的測(cè)定:精密稱取提取物20 mg，以蒸餾水定容至100 mL 容量瓶中，移取0.5 mL 置20 mL 具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法進(jìn)行操作，在波長490 nm 處測(cè)得樣品的吸光度數(shù)值，由回歸方程計(jì)算樣品中多糖的含量(以葡萄糖計(jì))。

1.3 單因素試驗(yàn)

選擇對(duì)多糖含量有較大影響的提取溫度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素進(jìn)行研究。

1.3.1 提取溫度的篩選稱取太子參粉末30 g，料液比1∶9，用蒸餾水提取2次，每次120 min，選擇提取溫度分別為60、70、80、90、95℃，按照樣品制備方法制備樣品，測(cè)定吸光度，確定最佳提取溫度。

1.3.2 提取時(shí)間的篩選稱取太子參粉末30 g，料液比1∶9，90℃溫度下用蒸餾水提取2次，選擇提取時(shí)間分別為60、120、180、240 min，按照樣品制備方法制備樣品，測(cè)定吸光度，確定合適的提取溫度。

1.3.3 料液比的篩選稱取太子參粉末30 g，90℃溫度下用蒸餾水提取2次，每次120 min，選擇料液比分別為1∶3、1∶6、1∶9、1∶12、1∶15，按照樣品制備方法制備樣品，測(cè)定吸光度，確定合適的提取溫度。

1.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)確定的提取溫度下，選用料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，以太子參多糖得率為考察指標(biāo)，按照L9(34)正交表(表1)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平Tab.1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.5 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

為進(jìn)一步考察正交試驗(yàn)所得最佳工藝的穩(wěn)定性和合理性，按照優(yōu)化工藝條件進(jìn)行試驗(yàn)，3次重復(fù)，求平均值。

1.6 醇沉條件的篩選

選擇藥液濃縮程度和醇終濃度這兩個(gè)對(duì)太子參多糖的醇沉效果有較大影響的因素進(jìn)行研究。

1.6.1 藥液的濃縮程度對(duì)太子參多糖醇沉效果的影響稱取太子參粉末30 g 每份，按最佳工藝提取，濃縮藥液至藥液含量為1 g/mL，選擇醇終濃度分別為40%、60%、80%進(jìn)行醇沉，沉淀干燥，稱重，測(cè)定含量。

1.6.2 醇終濃度對(duì)太子參多糖醇沉效果的影響稱取太子參粉末30 g 每份，按最佳工藝提取，選擇藥液含量分別為0.5、1.0、1.5、2.0 g/mL 進(jìn)行醇沉，醇終濃度為80%，沉淀干燥，稱重，測(cè)定含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度對(duì)太子參多糖提取率的影響由圖1可知，提取溫度為90℃時(shí)，提取率最高，因此，優(yōu)先考慮提取溫度為90℃。

圖1 提取溫度對(duì)得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the extraction rate

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)太子參多糖提取率的影響由圖2可知，提取時(shí)間為180 min時(shí)提取率最高，因此，優(yōu)先考慮提取時(shí)間為180 min。

2.1.3 料液比對(duì)太子參多糖提取率的影響由圖3可知，隨著料液比的增大，提取效率逐漸增大，但料液比大于1∶9時(shí)，多糖的得率變化不大。從節(jié)省提取試劑方面考慮，優(yōu)先考慮料液比為1∶9。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)太子參多糖提取率影響較大的料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)，并設(shè)計(jì)3個(gè)因素水平，按照表1設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，以太子參多糖的得率為考察指標(biāo)，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

圖2 提取時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction rate

圖3 料液比對(duì)得率的影響Fig.3 Effect of the ratio of material to solution on the extraction rate

由表2和表3可知，3種因素對(duì)太子參多糖提取的影響從大到小依次為B＞A＞C，表明提取次數(shù)對(duì)太子參多糖提取率的影響是最大的。綜合試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)表明，太子參多糖的提取最佳工藝為A3B3C2，即在提取溫度90℃、提取時(shí)間180 min、提取次數(shù)3次、料液比1∶9時(shí)提取效果最好。

表2 正交試驗(yàn)及結(jié)果Tab.2 The results of the orthogonal experiment

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.3 醇沉條件篩選結(jié)果

2.3.1 藥液濃縮程度對(duì)太子參多糖醇沉效果的影響由圖4可知，醇終濃度為80%時(shí)醇沉效果最好，太子參多糖的得率最高。

圖4 藥液的濃縮程度對(duì)醇沉效果的影響Fig.4 Effect of liquid concentration degree on the alcohol precipitation

2.3.2 醇終濃度對(duì)太子參多糖醇沉效果的影響由圖5可知，醇終濃度為80%，藥液的生藥含量為1.5 g/mL時(shí)多糖的得率最高。

2.4 正交試驗(yàn)法優(yōu)化工藝的驗(yàn)證

以上試驗(yàn)得出太子參多糖的最佳提取工藝為:溫度90℃，料液比1∶9，提取3次，每次180 min，提取液濃縮至生藥含量為1.5 g/mL時(shí)進(jìn)行醇沉，醇終濃度80%，靜置濾去上清液，取沉淀冷凍干燥。在以上最佳提取條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證，試驗(yàn)通過多糖得率查看工藝穩(wěn)定性，結(jié)果見表4。

圖5 醇終濃度對(duì)醇沉效果的影響Fig.5 Effect of alcohol concentration on the alcohol precipitation

以上工藝驗(yàn)證3次，計(jì)算得多糖的平均得率為(21.41±0.3)%。3次結(jié)果差異較小，說明該工藝穩(wěn)定可行。

表4 正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果Tab 4 The verification results of the orthogonal experiment

3 討論

3.1 太子參多糖的干燥方式對(duì)多糖的形狀有很大的影響，高溫干燥時(shí)得到的多糖為紅褐色粉末，并有焦糖味，冷凍干燥則得到無味的白色粉末，得到多糖的性狀對(duì)其以后做成制劑的外觀性狀和口感要求有較大的影響。

3.2 太子參藥材粉碎的粒度對(duì)多糖的得率和抽濾的難易程度有影響。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，太子參藥材的粉碎粒度越細(xì)提取率會(huì)有相應(yīng)的提高，相對(duì)而言粒度越細(xì)抽濾的難度也越大。

本研究探討了提取太子參多糖的最佳工藝，為工業(yè)化提取太子參多糖提供了理論依據(jù)。

［1］林光美.太子參研究進(jìn)展［J］.中國野生植物資源，2004，23(6):15－17.

［2］鐘方小，彭廣芳，李貴海，等.山東太子參多糖含量對(duì)質(zhì)量的影響［J］.中草藥，1997，28(7):428－430.

［3］張陸軍，丁怡，陳蕓蕓，等.太子參多糖制備工藝研究［J］.中國中藥雜志，2004，29(12):1201－1203.