鮮思美

(貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州省動物疫病研究所，貴州貴陽 550025)

小鵝瘟(Gosling plague，GP)是由鵝細(xì)小病毒(Goose Parvovirus，GPV)引起雛鵝的一種高致死性疾病，又稱鵝細(xì)小病毒感染(Goose parvovirus infection，GPVI)或Derzsy’s 病。該病是以急性腸炎及肝、腎、心臟實(shí)質(zhì)臟器敗血性病變?yōu)樘卣鞯牧倚詡魅静?，傳播迅速，?～20日齡雛鵝消化道，尤以小腸部位的纖維素性、栓塞性病變?yōu)橹饕卣?。該病病程短促，傳染性?qiáng)，傳播快，死亡率高［1］。

番鴨細(xì)小病毒病是由番鴨細(xì)小病毒(Muscovy duck Parvovrius，MDPV)引起侵襲雛番鴨為主的一種急性傳染病，臨床上以喘氣、腹瀉及胰臟壞死和出血為主要特征［2］。鵝細(xì)小病毒病和番鴨細(xì)小病毒病是嚴(yán)重危害水禽飼養(yǎng)業(yè)的傳染病，臨床上常在同一地區(qū)流行，甚至混合感染。兩種疫病的流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化都非常相似;兩種病毒的大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)蛋白、理化特性、核酸類型和基因組結(jié)構(gòu)等方面也非常相似，兩者的血清也有一定的交叉保護(hù)性，用常規(guī)的血清學(xué)檢測方法很難將這兩種病毒區(qū)分，臨床上鑒別診斷難度較大。我國是發(fā)現(xiàn)和研究鵝細(xì)小病毒病和番鴨細(xì)小病毒病最早的國家，于1988年在國內(nèi)外首次明確了MDPV 不同于GPV，兩者存在差異［3－4］。本文從病毒的基因組結(jié)構(gòu)、病毒編碼蛋白方面進(jìn)行比較分析，概述兩種病毒在基因組結(jié)構(gòu)和抗原性上存在的差異及已建立的鑒別診斷方法。

1 病毒的基因組結(jié)構(gòu)比較

GPV與MDPV 兩者同屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，基因組為單股、線狀DNA，正極性DNA 鏈的病毒粒子和含有負(fù)極性DNA 鏈的病毒粒子數(shù)目基本相等［5］。匈牙利學(xué)者Zadori［6］(1995)對GPV和MDPV 毒株進(jìn)行了核苷酸序列測定，并與禽和哺乳動物的細(xì)小病毒進(jìn)行了比較。MDPV FM株核苷酸長為5132 bp，GPV B株核苷酸長為5106 bp，兩者在核苷酸水平上有81.9%相同。GPV 全基因結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 GPV 基因組結(jié)構(gòu)圖(5106 bp)Fig.1 Genome structure of GPV(5106 bp)

賀娟［7］(2007)將GPV和MDPV的基因序列進(jìn)行了比對:(1)GPV 179～4910 bp 序列與MDPV187～4927 bp 序列方向相同，同源性為82%;(2)GPV 4919～5105 bp與MDPV187～1的同源性為85%，但方向相反;(3)GPV93～177 bp 序列與MDPV 5083～4998 bp 同源性為94%，但方向相反;(4)GPV的2～151 bp 序列與MDPV5132～4980 bp同源性為88%，方向也是相反。GPV 較MDPV 基因組序列少的26 bp 分布于:左側(cè)ITR 序列中，GPV 缺失11 bp;右側(cè)ITR中，GPV 較MDPV少10 bp;在結(jié)構(gòu)蛋白(VP)終止子后，GPV 較MDPV 少5 bp。GPV 較MDPV 基因組序列少的26 bp全部分布于非編碼序列中。GPV 較MDPV 基因組中編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域，兩者之間大小相同，不存在缺失或額外的插入序列，而是表現(xiàn)為堿基替代。張?jiān)频龋?］(2008)發(fā)現(xiàn)鵝和番鴨細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因(NS)全長為1884 bp，編碼627個氨基酸;結(jié)構(gòu)基因(VP)全長為2199 bp，編碼732個氨基酸;鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒NS 之間的核苷酸和氨基酸同源性分別為80.9%～82.9%和89.5%～91.2%，而鵝細(xì)小病毒間為93.7%～99.8%和96.8%～99.7%，番鴨細(xì)小病毒間為98.8%～99.8%和98.6%～99.5%;鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒VP1之間核苷酸和氨基酸同源性分別為79.7%～88.7%和85.5%～93.3%，而相應(yīng)的鵝細(xì)小病毒間為88.8%～99.6%和91.5%～99.2%，番鴨細(xì)小病毒間為98.1%～99.6%和97.1%～98.8%。婁華等［9］(2001)將MDPV－Q VP2蛋白基因序列與GPV VP2蛋白基因序列進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)其同源性只有80.5%。季芳等［10］(2004)比較了MDPV GD株和GPV GD株，基因組同源性達(dá)81.30%，VP1基因編碼的核苷酸的同源性為87%，VP2基因核苷酸同源性為84%，VP3基因核苷酸同源性為80%。兩種病毒的VP2至VP3起始密碼子之間的核苷酸存在較大差異，其同源性僅為64%。GPV和MDPV的Rep 基因的同源性達(dá)90.6%。孔憲剛等［11］(2005)將GPV HG5/82株基因與MDPV的NS 基因進(jìn)行序列比較，核苷酸同源性為81%，氨基酸同源性為89%，有65個氨基酸發(fā)生變異，主要集中在NS 蛋白的羧基端。將HG5/82與國外發(fā)表的MDPV FM株的結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行比較，其核苷酸及氨基酸序列同源性分別為80%和85%。其中有102個氨基酸發(fā)生變異，主要集中在VP2和VP3起始密碼子之間的146～198位氨基酸。GPV VP2起始密碼子為不典型的ACG，而MDPV VP2的起始密碼子為典型的ATG。GPV 結(jié)構(gòu)基因中的4個糖基化位點(diǎn)有3個，與MDPV 相同，而位于結(jié)構(gòu)基因700～702位的NFS 在MDPV中變?yōu)镹FG。MDPV結(jié)構(gòu)基因共有6個糖基化位點(diǎn)，位于3個結(jié)構(gòu)基因的共同區(qū)。GPV與MDPV 氨基酸序列在440～530位變化較大，其中GPV 結(jié)構(gòu)基因在443～445位為NFN，而MDPV 在此為糖基化位點(diǎn)NFS;GPV 在493～495位為NWN，而MDPV 為NWS。糖基化位點(diǎn)與病毒和宿主細(xì)胞的吸附有關(guān)，是病毒感染宿主的必需區(qū)，因此推測這些糖基化位點(diǎn)的差異可能與病毒感染宿主的特異性有關(guān)。程由銓等［12］(2001)采用限制性核酸內(nèi)切酶酶切技術(shù)對MDPV和GPV退火形成的雙鏈DNA和經(jīng)Klenow 酶合成的雙鏈DNA 進(jìn)行分析，證明MDPV和GPV 核酸的EcoR I、Kpn I和Sac I 酶切位點(diǎn)不同，合成的雙鏈MDPV和GPV 核酸的Sac I、BstX I、Bg Ⅲ、Pst I和EcoR I 酶切位點(diǎn)不同，從而表明MDPV和GPV 核酸在結(jié)構(gòu)上有明顯差異。李雪梅等［13］(2001)對國內(nèi)4株GPV和2株MDPV的Rep 基因進(jìn)行酶切分析比較，發(fā)現(xiàn)酶切位點(diǎn)有較大差異，即GPV 缺乏Sac I位點(diǎn)，但有Pst I 位點(diǎn)，不同毒株間EcoR I 位點(diǎn)有差異;而MDPV 則有Sac I和EcoR I 位點(diǎn)，但無Pst I位點(diǎn)。

2 病毒編碼蛋白比較

根據(jù)核苷酸全序列分析，基因組有兩個開放閱讀框(ORF)，左側(cè)閱讀框(LORF)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(Rep1，Rep2)，右側(cè)閱讀框(R0RF)編碼3種核衣殼蛋白VP1、VP2、VP3，這3種蛋白起始密碼子位于不同部位，但終止密碼子處于同一位置。關(guān)于MDPV對其結(jié)構(gòu)蛋白說法不一，法國學(xué)者C.LeCall－Recule等［14］(1994)進(jìn)行SDS－PAGE 電泳時，發(fā)現(xiàn)在51kD 左右處有1條淡染的蛋白帶;匈牙利學(xué)者Z.Zadori［6］(l995)根據(jù)蛋白凝膠電泳分析，MDPV 有3條結(jié)構(gòu)多肽，分子量分別為VP191kD、VP278kD、VP358kD。而我國孟松樹等［15］(1994)、王永坤等［16］(2004)研究表明，MDPV 有4條結(jié)構(gòu)多肽，分別為VP1、VP2、VP3、VP4，分子量分別為VP189kD、VP268kD、VP358kD、VP4為40kD。其中，VP3為主要結(jié)構(gòu)多肽，占總含量的78.5%，而VP1含量為9.4%，VP2為7.2%，VP4為4.9%。GPV出現(xiàn)3條結(jié)構(gòu)多肽，即VP1分子量為85000，VP2為61000，VP3為57500。其中，VP3為主要結(jié)構(gòu)多肽，占總含量的79.9%，而VP1為8.3%，VP2為11.8%。Chapaman等［17］(1993)分析了幾種細(xì)小病毒粒子核衣殼，發(fā)現(xiàn)GPV、MDPV 位于病毒粒子表面的VP3多肽略有差異。最大不同之處是位于VP2、VP3啟動子之間162位和178位氨基酸，而其蛋白分子差異不明顯。張建珍等［18］也報(bào)道MDPV、GPV 有一定的交叉反應(yīng)性，兩者的共同抗原基因主要位于VP3上，而主要差異存在于VP1和VP2。Chu等［19］發(fā)現(xiàn)，GPV與MDPV 差異最多的序列集中于VP3的203－266及482－534位的氨基酸殘基(VP1的401－464和680－732位氨基酸殘基)。黎明等［20］采用生物信息學(xué)方法，預(yù)測MDPV和GPV 非結(jié)構(gòu)蛋白可能發(fā)生交叉反應(yīng)的區(qū)段為AA503－509。衣殼蛋白可能發(fā)生交叉反應(yīng)的區(qū)段為AA321－325、426－430、540－544和685－691。

3 鑒別診斷方法

3.1 動物感染試驗(yàn)

MDPV 只能感染番鴨及番鴨源細(xì)胞，而GPV既能感染鵝，又可以感染番鴨及其體外培養(yǎng)細(xì)胞［21］。林世棠［22］、程由銓等［23］將MDPV 經(jīng)各種途徑接種雛番鴨、雛半番鴨、雛鵝、5日齡莆田黑鴨、6日齡櫻桃谷鴨、北京鴨和雜種鴨，只有雛番鴨于接種后3～7 d 出現(xiàn)與自然患病相似的臨床癥狀，發(fā)病率為52.6%，致死率為47.4%，其他水禽觀察20 d 均健活。Glavits等［24］將3株從水禽分離的細(xì)小病毒(兩株為鵝細(xì)小病毒，1株為番鴨細(xì)小病毒)人工感染3周齡的雛鵝和雛番鴨，結(jié)果3株細(xì)小病毒均能引起雛番鴨發(fā)病，而兩株鵝細(xì)小病毒僅能使雛鵝感染發(fā)病。

3.2 血清學(xué)試驗(yàn)

王永坤等［4］采用交叉免疫轉(zhuǎn)印試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MDPV的多抗與MDPV、GPV 都出現(xiàn)了兩條反應(yīng)帶VP3、VP2;GPV的多抗和MDPV 只有1條反應(yīng)帶VP3，與GPV 出現(xiàn)3條反應(yīng)帶VP1、VP2、VP3;MDPV 單抗僅識別MDPV和GPV的VP3，GPV 單抗在識別GPV VP3和VP2的同時，還識別MDPV的VP3。說明MDPV和GPV的共同抗原主要在占整個衣殼蛋白比例大的VP3上，兩者的VP1和VP2存在差異。程由銓等［25］(1997)、胡奇林等［26］(2000)通過ELISA、FA、NT、AGP、LPA 試驗(yàn)對番鴨細(xì)小病毒和鵝細(xì)小病毒抗原進(jìn)行分析，番鴨細(xì)小病毒單抗只與番鴨細(xì)小病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，與小鵝瘟病毒不發(fā)生特異性反應(yīng);小鵝瘟病毒單抗只與小鵝瘟病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，不與番鴨細(xì)小病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，表明兩者在抗原結(jié)構(gòu)上存在顯著差異，同時明確了送檢病料中以肝、脾組織為首選材料?？乖陨系母叨韧唇o用血清學(xué)方法鑒別診斷這兩種疾病造成了困難，在ELISA、FA、NT和LA等血清學(xué)檢測方法中，只有應(yīng)用MDPV和GPV 克隆抗體才能將這兩種病毒區(qū)分開來。

3.3 PCR 技術(shù)

因GPV和MDPV的NS 基因酶切位點(diǎn)有較大差異，Sirivan等［27］(1998)對來自泰國的17個毒株進(jìn)行了PCR 擴(kuò)增和DNA 分子雜交后，采用限制性內(nèi)切酶消化PCR 產(chǎn)物，有2株病毒不同于另外的15株，兩株病毒無HincⅡ和Bg Ⅲ，而有EcoR Ⅰ位點(diǎn)，采用限制性片段長度多態(tài)性PCR－RFLP(Polymerase Chain Reaction－Restriction Fragment Length Polymorphism)分析PCR 產(chǎn)物可用于區(qū)分MDPV和GPV。

婁華等［28］(2000)比較了GenBank中MDPV和GPV的基因序列，并針對這兩種病毒NS 基因序列的相同區(qū)段，分別設(shè)計(jì)了兩對PCR 引物。引物L(fēng)HMP1/LHMP2只特異地?cái)U(kuò)增MDPV，而引物L(fēng)HGP1/LHGP2也只特異性地?cái)U(kuò)增GPV，并且兩對引物均擴(kuò)增出約720 bp的長度序列，為兩種疾病的準(zhǔn)確、快速鑒別診斷奠定了基礎(chǔ)。胡奇林等［29］(2001)在MDPV和GPV 基因組保守區(qū)設(shè)計(jì)了1對通用引物(PC1/PC2)，在MDPV和GPV 基因組的非同源區(qū)設(shè)計(jì)了1對MDPV 特異引物(PS1/PS2)，建立了能對番鴨胚尿囊液和細(xì)胞培養(yǎng)液中的MDPV和GPV 進(jìn)行快速診斷和鑒別診斷的PCR 檢測技術(shù)。季芳等［30］(2003)在NS 區(qū)設(shè)計(jì)了1個通用引物PVC，在MDPV、GPV 非同源區(qū)設(shè)計(jì)了各自的特異性引物MDPVdn、GPVdn，其中PVC/MDPVdn能特異鑒別MDPV的存在，PVC/GPVdn 能特異鑒別GPV的存在，若將3種引物置于同一反應(yīng)體系中，能鑒別兩種病毒同時存在。劉家森等［31］(2007)、季艷菊等［32］(2007)根據(jù)GPV和MDPV 基因組的非同源序列，分別設(shè)計(jì)了針對GPV和MDPV的引物。但所設(shè)計(jì)引物僅能擴(kuò)增特定病毒的核酸片段，對其他病毒核酸沒有擴(kuò)增。賀娟［7］(2007)在VP1基因中尋找同源性較低的兩處，設(shè)計(jì)的引物能特異性地?cái)U(kuò)增出GPV的條帶，而對照毒株不能擴(kuò)增出470 bp的條帶。鮮思美［33－34］(2009，2010)針對兩種病毒NS和VP1基因序列的相同區(qū)段設(shè)計(jì)了兩對引物，建立了番鴨細(xì)小病毒與鵝細(xì)小病毒PCR 鑒別診斷方法;并設(shè)計(jì)了針對GPV NS和MDPV NS2－ VP1基因片段的兩對引物，建立了能同時檢測這兩種病毒的雙重PCR。

4 小結(jié)

鵝細(xì)小病毒與番鴨細(xì)小病毒在病毒大小、形態(tài)結(jié)構(gòu)、理化特性、核酸類型、免疫學(xué)特性等方面極為相似。兩者的差異主要表現(xiàn)為:(1)致病特性，MDPV 僅感染雛番鴨，而GPV可感染雛番鴨和雛鵝;(2)抗原性方面，MDPV與GPV 用常規(guī)血清學(xué)作交叉和試驗(yàn)，有較明顯的交叉保護(hù)作用，但用單克隆抗體作ELISA、FA等發(fā)現(xiàn)有不交叉的抗原成分;(3)MDPV和GPV 在核酸序列上有明顯差異，可針對兩種病毒的非同源區(qū)設(shè)計(jì)引物，采用PCR 技術(shù)對這兩種疾病進(jìn)行鑒別診斷。除此之外，也可采用限制性內(nèi)切酶技術(shù)、PCR 產(chǎn)物結(jié)合測序的方法和PCR－RFLP對這兩種細(xì)小病毒進(jìn)行鑒別診斷。

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