李道坤張 帆* 孫維權(quán)張 勤龔文容

（1 湖北文理學(xué)院，湖北 襄陽 441053；2湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 襄陽 441021）

重組CEA和IL-2抗腫瘤基因疫苗的構(gòu)建及其抗腫瘤作用研究

李道坤1張 帆2* 孫維權(quán)1張 勤1龔文容1

（1 湖北文理學(xué)院，湖北 襄陽 441053；2湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 襄陽 441021）

目的 成功構(gòu)建重組CEA、CEA/IL-2抗腫瘤基因疫苗，并檢測其激活的淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。方法 將CEA、CEA/ IL-2基因?qū)胝婧吮磉_(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1，并轉(zhuǎn)染入DC細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)染DC細(xì)胞活化淋巴細(xì)胞，將活化的淋巴細(xì)胞與人CEA+肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果 重組CEA、CEA/IL-2組均檢測出較強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)，且重組CEA/IL-2組與重組CEA組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 聯(lián)合CEA/IL-2基因疫苗具有抗腫瘤作用，且其抗腫瘤作用明顯優(yōu)于單基因CEA基因疫苗，證實(shí)了重組腫瘤基因疫苗對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

基因疫苗；CEAIL-2；抗腫瘤

癌癥的治療一直是醫(yī)學(xué)界一道未能攻克的難題，隨著分子生物學(xué)以及遺傳學(xué)的發(fā)展，腫瘤的基因疫苗為腫瘤治療開辟了一條新的途徑，基因疫苗能夠有效地將其編碼的抗原提呈給免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)廣泛的免疫應(yīng)答，從而自身清除腫瘤細(xì)胞。癌胚抗原（Carcinoembryonicantigen，CEA）是最早發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)抗原（TAA），屬于胚胎性癌蛋白[1]。CEA已作為腫瘤標(biāo)志物，用于一些腫瘤的輔助診斷與監(jiān)測。近年來，以CEA為靶點(diǎn)的腫瘤免疫治療研究取得了很大進(jìn)展。CEA的存在是其陽性腫瘤基因疫苗治療的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，盡管大多數(shù)惡性腫瘤患者體內(nèi)有高水平的CEA表達(dá)，但由于免疫原性弱或抗原提呈障礙，不能有效激活機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)CEA的免疫應(yīng)答。因此，通過各種途徑增強(qiáng)CEA的免疫原性，使其能有效地激活T細(xì)胞，打破機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫耐受，成為了CEA基因疫苗研究的主要問題。將DNA疫苗抗原基因與免疫刺激分子基因結(jié)合起來共表達(dá)可大大增強(qiáng)體內(nèi)抗原特異性免疫應(yīng)答，尤其是IL-2分子，已被證明在體內(nèi)外均有增強(qiáng)細(xì)胞免疫的作用。制備這種基因疫苗目的在于提供具有更專一的靶向性、更強(qiáng)免疫原性的抗原表位，同時(shí)促進(jìn)DC、NK、CTL的增殖、分化和成熟的功能，提高DNA疫苗產(chǎn)生Th1 型免疫反應(yīng)[2]，達(dá)到體內(nèi)持續(xù)、有效地激活參與抗腫瘤免疫的多種效應(yīng)細(xì)胞，解除機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫耐受，產(chǎn)生抗腫瘤免疫效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞株

質(zhì)粒pcDNA3.1，人CEA+肝癌細(xì)胞，大腸桿菌DH5α由本室保存。

1.1.2 主要儀器及試劑

低溫高速離心機(jī)Allergra 64R；多通道PCR 擴(kuò)增儀MJ PTC-220；凝膠電泳成像分析系統(tǒng)Gel DOC2000；美國產(chǎn)紫外分光光度儀Lambda20；恒多電泳儀ECP3000；rTaq DNA聚合酶、dNTPs、限制性內(nèi)切酶（XhoⅠ、MLuⅠ、SalⅠ、NotⅠ）、T4DNA連接酶、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker2000購于TaKaRa生物工程公司；無內(nèi)毒素超純型質(zhì)粒DNA純化試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒等試劑均購自Vitagene公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人CEA+肝癌細(xì)胞總RNA的提取、鑒定及RT-PCR擴(kuò)增

按照Invitrogen公司RNA提取試劑盒一步法提取細(xì)胞總RNA，總RNA提取液進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用紫外分光光度計(jì)測定A260和A280值，-70℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

參照文獻(xiàn)方法[3]，以人CEA+肝癌細(xì)胞總RNA為模版，根據(jù)GenBank及pcDNA3.1序列圖譜酶切位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)合成兩對(duì)引物P1、P2和P3、P4：P1 5-CTCGAGATGGAGTCTCCCTCGGCCCCTC-3；P2 5-ACGCGTCTATATCAGAGCAACCCCAACCAGCAC-3；P3 5-GTCG ACATGTACAGGATGCAACTCCTGTC-3；P4 5-GCGGCCGCTTATCA AGTCAGTGTTGAGATGATG-3。RT- PCR擴(kuò)增出CEA，hIL-2目的基因，分別引入XhoⅠ、MLuⅠ與SalⅠ、NotⅠ兩組四個(gè)酶切位點(diǎn)[4]。

1.2.2 重組質(zhì)粒pcDNA-CEA、pcDNA-CEA/IL-2的構(gòu)建

分別用XhoⅠ、MluⅠ雙酶切P1、P2為引物RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pcDNA3.1，酶切完成后回收酶切產(chǎn)物，按照RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒pcDNA3.1酶切產(chǎn)物分子比10?1連接，按說明書操作。連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)的E.coli DH5α細(xì)胞，并接種于含有氨芐青霉素（50 μg/ mL）的LB平板上進(jìn)行抗生素抗性篩選，倒置平板培養(yǎng)過夜后，選取生長良好的單菌落，小量增菌后提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR，雙酶切鑒定，經(jīng)初步鑒定后測序鑒定；分別用SalⅠ、NotⅠ雙酶切P3、P4為引物RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和鑒定成功的pcDNA-CEA質(zhì)粒，酶切完后膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、篩選，PCR、雙酶切、測序鑒定，提取測序鑒定成功的重組質(zhì)粒pcDNA-CEA、pcDNA-CEA/IL-2備用。

1.2.3 樹突狀細(xì)胞（DC）的制備以及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

取正常人外周血100mL，分離獲得單核細(xì)胞，RPMI1640洗滌2遍，在含10%的人AB型血清的RPMI1640和5%CO237℃條件下培養(yǎng)2h，輕輕吸出懸浮細(xì)胞，然后加入含GM-CSF（800u/mL）、IL-4（500u/mL）及5%人AB型血清的RPMI1640，在5%CO237℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每2天半量換液1次。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，第6天將上述細(xì)胞分為4組：第1組（質(zhì)粒pcDNA3.1組）加入質(zhì)粒pcDNA3.1 10μmol/mL 100μL，24h，每2h輕輕晃動(dòng)1次，然后輕輕洗滌細(xì)胞祛除未轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒pcDNA3.1；第2組（質(zhì)粒pcDNA-CEA組）加入質(zhì)粒pcDNA-CEA 10μmol/mL 100μL，操作同上；第3組（質(zhì)粒pcDNACEA/IL-2組）加入質(zhì)粒pcDNA-CEA/IL-2 10μmol/mL 100μL，操作同上；第4組（無質(zhì)粒對(duì)照組）加入含5%人AB型血清的RPMI1640 100μl，操作同上。收集各組細(xì)胞用流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表型并經(jīng)放射線照射滅活（60Co，30Gy），備用。

1.2.3 各組DC對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)

將上一步獲得的非黏附細(xì)胞（主要為T細(xì)胞）用10%人AB型血清的RPMI1640稀釋成1×106/mL、5×106/mL，分別加入96孔培養(yǎng)板（100μL/孔），按T細(xì)胞的1/10分別加入質(zhì)粒pcDNA3.1、pcDNACEA、pcDNA-CEA/IL-2的轉(zhuǎn)染成功以及無質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組的DC，設(shè)立空白培養(yǎng)基孔作為對(duì)照，37℃、5%CO2孵育72h，每組6孔在終止培養(yǎng)前4h，每孔加入XTT/PMS 25μL（終濃度：XTT 0.297mmol/L，PMS 5umol/L）測定吸光度（A）值；測量波長450nm，計(jì)算刺激指數(shù)（stimulating index，SI）（SI=實(shí)驗(yàn)組A450/空白組A450）

1.2.4 T細(xì)胞對(duì)人CEA+肝癌細(xì)胞的殺傷作用

將對(duì)數(shù)生長期的人CEA+肝癌細(xì)胞稀釋成1×106/mL、5×106/ mL，分別加入96孔培養(yǎng)板（100μL/孔），按人CEA+肝癌細(xì)胞的1∶10，分別加入質(zhì)粒pcDNA3.1、pcDNA-CEA、pcDNA-CEA/IL-2的轉(zhuǎn)染成功組DC激活的T細(xì)胞以及以及無質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組DC激活T細(xì)胞，設(shè)立空白培養(yǎng)基孔作為對(duì)照。37℃、5%CO2孵育72h，每組6孔在終止培養(yǎng)前4h，每孔加入XTT/PMS 25μL（終濃度：XTT0.297 mmol/L，PMS5μmol/L）測定吸光度（A）值；測量波長450nm，計(jì)算刺激指數(shù)SI=實(shí)驗(yàn)組A450/空白組A450。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pcDNA-CEA、pcDNA-CEA/IL-2的構(gòu)建及檢測

以人CEA+肝癌細(xì)胞總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增出目的基因片段，與GenBank相符，目的基因片段分別與pcDNA3.1載體連接，構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pcDNA-CEA、pcDNA-CEA/IL-2經(jīng)PCR 鑒定結(jié)果如圖1。將初步篩選成功的重組質(zhì)粒pcDNA-CEA、pcDNA-CEA/IL-2經(jīng)大連寶生物工程有限公司測序，報(bào)告在GenBank上BLAST對(duì)比完全一致，證實(shí)無突變及缺失。

圖1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定

2.2 DC表型分析

流式細(xì)胞儀對(duì)DC表型的分析表明，pcDNA3.1、pcDNA-CEA、 pcDNA-CEA/IL-2及空白對(duì)照組DC，均表達(dá)DC特異性分化抗原CD83[（45.3±9.5）%、（46.6±8.1）%、（45.7±11.2）%及（46.7 ±10.2）%]、HLA-DR[（54.1±5.6）%、（57.8±7.7）%、（55.2± 7.3）%及（57.7±6.2）%]，4組差異無顯著性（P＜0.05）。

2.3 T細(xì)胞增殖的效應(yīng)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性

采用XTT法測定T細(xì)胞對(duì)各種刺激的增殖作用，發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1、pcDNA-CEA、pcDNA-CEA/IL-2及無質(zhì)粒對(duì)照組DC結(jié)果見表1，對(duì)各組進(jìn)行組間對(duì)比，當(dāng)1×106/mL淋巴細(xì)胞時(shí)，pcDNA-CEA、pcDNACEA/IL-2組分別與pcDNA3.1組、無質(zhì)粒對(duì)照組對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；當(dāng)5×106/mL淋巴細(xì)胞時(shí)，pcDNA-CEA、pcDNACEA/IL-2組分別與pcDNA3.1組、無質(zhì)粒對(duì)照組對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。pcDNA-CEA、pcDNA-CEA/IL-2組內(nèi)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；XTT法測定T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用結(jié)果表明，各組DC激活的T細(xì)胞對(duì)人CEA+肝癌細(xì)胞殺傷作用結(jié)果如表1，對(duì)各組進(jìn)行組間對(duì)比，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異與T細(xì)胞增殖效應(yīng)相同。

表1 T細(xì)胞增殖的效應(yīng)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性

3 討 論

腫瘤細(xì)胞在生長過程中，可能暫時(shí)性調(diào)整甚至關(guān)閉其自身的TAA，通過逃避DC的抗原遞呈從而逃避機(jī)體免疫殺傷。因此，如果能獲得TAA，以一定的方式導(dǎo)入DC，就可克服這一難題，誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫，達(dá)到治療腫瘤的目的[4]。CEA是一種位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)膜表面的膜結(jié)合蛋白，是多種消化道腺癌，尤其是大腸癌細(xì)胞所表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原。近年研究表明CEA具有一定的抗原性，可以作為誘導(dǎo)腫瘤免疫的有效靶抗原。但其主要不足是由其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答強(qiáng)度較弱，難以達(dá)到對(duì)腫瘤的治療作用。如何提高疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)是腫瘤基因疫苗能否最終應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵[5]。自1976年Marsen發(fā)現(xiàn)IL-2以來[6]，其抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)功能已越來越明確，這種由活化的輔助T細(xì)胞分化產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在腫瘤免疫中起關(guān)鍵作用，它可誘導(dǎo)、擴(kuò)增細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞、腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞、淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞，從而發(fā)揮抗腫瘤和提高機(jī)體免疫功能的作用[7]。

基于以上研究基礎(chǔ)，本研究將IL-2、CEA基因?qū)隓C，使DC表達(dá)該TAA，同時(shí)IL-2能增強(qiáng)CEA的細(xì)胞免疫，將TAA的多個(gè)表位與MHC分子相結(jié)合表達(dá)于細(xì)胞表面，從而更有效地激活T淋巴細(xì)胞。經(jīng)基因轉(zhuǎn)染DC制備DC疫苗，可使DC持續(xù)表達(dá)該TAA，從而解決了傳統(tǒng)DC疫苗制備時(shí)，腫瘤細(xì)胞或TAA抗原肽來源困難、特異性不足、以及TAA解離或降解而影響其DC功能的問題，并且避免誘發(fā)自身免疫性疾病的危險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明聯(lián)合CEA/IL-2基因疫苗具有抗腫瘤作用，且其抗腫瘤作用明顯優(yōu)于單基因CEA基因疫苗，從而初步證實(shí)了重組腫瘤基因疫苗對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

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R364

B

1671-8194（2013）35-0050-03

湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2011CDA065）

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