許均華, 李高陽(yáng),2,*

(1.中南大學(xué)隆平分院,湖南長(zhǎng)沙 410125;2.湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,湖南長(zhǎng)沙 410125)

用花生分離蛋白制備抗氧化活性肽的方法很多,制備途徑主要有酸堿水解法、生物合成法、微生物發(fā)酵法、酶解法[1-5].因?yàn)槊附夥▋r(jià)格低廉,易進(jìn)行、易控制、易分離,安全性高而受到廣泛關(guān)注[6].由于花生分離蛋白分子結(jié)構(gòu)致密,且蛋白酶具有底物專一性[7],為了得到較好的水解效果,采用復(fù)合酶進(jìn)行水解在實(shí)際生產(chǎn)中具有現(xiàn)實(shí)意義.

目前,蛋白功能肽的開(kāi)發(fā)已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)[1-4],但花生分離蛋白肽研究很少.本研究探討不同蛋白酶其最適酶解條件下的水解能力,比較其清除DPPH自由基能力和水解度(DH)的相關(guān)性,確定復(fù)合酶的組成.根據(jù)酶水解原理和響應(yīng)面統(tǒng)計(jì)法研究花生分離蛋白酶水解制備抗氧化肽,為花生分離蛋白開(kāi)發(fā)利用提供參考.

1 材料與儀器

1.1 材料

花生分離蛋白,實(shí)驗(yàn)室自制.堿性蛋白酶Alcalase、固體木瓜蛋白酶Papain(S)、中性蛋白酶Neutrase、風(fēng)味蛋白酶Flavorzyme、胃蛋白酶、胰蛋白酶均為食品級(jí),丹麥諾維信有限公司;二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基 ,分析純,Sigma有限公司;石油醚、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、甲醛等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

1.2 主要儀器與設(shè)備

HH-S26型恒溫水浴鍋,北京科偉永興儀器有限公司;Avanti J-26 XP型冷凍離心機(jī),美國(guó)貝克曼有限公司;7750031 Free Zone型4.5L冷凍干燥機(jī) ,美國(guó)Labconco有限公司;UV-1700型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),日本島津分析儀器廠;Delta 320型pH酸度計(jì) ,瑞士梅特勒-托利多集團(tuán).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 水解度的測(cè)定

水解度(degree of hydrolysis,DH)測(cè)定方法同參考文獻(xiàn)[8].

1.3.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定

測(cè)定方法同參考文獻(xiàn)[8].

1.3.3 花生分離蛋白的制備方法

測(cè)定方法同參考文獻(xiàn)[8].

1.3.4 花生分離蛋白酶水解物的制備

配制適量質(zhì)量濃度(W/V)的花生分離蛋白溶液,用0.1 moL/L NaOH溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液pH值至預(yù)定值,再選用復(fù)合蛋白酶分別在其最適的條件下酶解花生分離蛋白.在酶反應(yīng)器中,及時(shí)加入NaOH溶液維持pH值不變.水解一定時(shí)間后,調(diào)pH值為4.5,95℃加熱10 min滅酶.4 000 r/min離心15 min,所得上清液即為花生分離蛋白水解液.

1.3.5 蛋白酶的篩選

選用堿性蛋白酶(alcalase)、中性蛋白酶(neutrase)、固體木瓜蛋白酶(papain)、胰蛋白酶(parenzyme)、胃蛋白酶(pepsin)等5種蛋白酶在其各自最優(yōu)條件下對(duì)花生分離蛋白進(jìn)行水解,以DPPH自由基清除率和DH為指標(biāo),篩選出清除率和DH都比較理想的兩到三種蛋白酶進(jìn)行后續(xù)復(fù)配實(shí)驗(yàn).

進(jìn)行復(fù)配實(shí)驗(yàn)時(shí),選取兩到三種酶制劑進(jìn)行復(fù)合酶篩選實(shí)驗(yàn),蛋白底物濃度為(W/V)5%,復(fù)配比例為1∶1(酶添加量),酶添加總量為3%,在各酶水解最適條件下,水解3 h.

1.3.6 復(fù)合酶比例的確定

經(jīng)過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)可知,酶解約束條件為底物質(zhì)量濃度(W/V)5%,酶添加總量3%,水解溫度55℃,水解pH 8.0,水解3 h,設(shè)定9個(gè)不同水平的復(fù)配比例,研究效果較好的兩種酶制劑之間量的不同配比對(duì)花生分離蛋白蛋白酶解效果的影響.同時(shí)以胰蛋白酶和堿性蛋白酶在同等條件下的花生分離蛋白水解液作為對(duì)照,確定堿性蛋白酶和胰蛋白酶的最佳復(fù)合酶比例.

1.3.7 復(fù)合蛋白酶組合風(fēng)味蛋白酶水解條件篩選

對(duì)比單酶和復(fù)合酶的水解效果:經(jīng)過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)可知,確定復(fù)合酶(堿性酶+胰酶)水解粗略的適宜水解條件為底物質(zhì)量濃度(W/V)為5%,酶添加總量(E/S)為3%,水解溫度55℃,水解pH值8.0,水解180 min,以DPPH清除率,DH為指標(biāo),改變風(fēng)味蛋白酶添加時(shí)間、酶解時(shí)間、酶量、pH值、溫度中的一個(gè)參數(shù),分別測(cè)定其清除率和水解度,確定風(fēng)味蛋白酶的較佳單因素條件.

1.3.8 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)重復(fù)次3次,結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差.在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,選取pH值(X1)、溫度(X2)、酶添加總量(X3)和酶解時(shí)間(X4)4個(gè)主要因素,以酶解液的DPPH自由基清除率為響應(yīng)值,通過(guò) Design Expert 8.0.4軟件,根據(jù) Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)了四因素三水平共29組實(shí)驗(yàn)(其中有5次為重復(fù)的中心點(diǎn),用于估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差)對(duì)預(yù)處理工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析,求出數(shù)學(xué)模型,得到較佳工藝參數(shù).因素水平編碼表見(jiàn)表1.

表1 試驗(yàn)因素水平編碼表Tab.1 Coded levels of variables of response surface design

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

單因素所得數(shù)據(jù)采用Excel處理,響應(yīng)面試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SAS與STATISTIC統(tǒng)計(jì)軟件分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 花生分離抗氧化肽粉的組成分析

通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定了花生抗氧化肽粉組成成分的質(zhì)量百分比,并與原花生分離蛋白成分質(zhì)量百分比進(jìn)行比較,具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2.花生抗氧化肽粉中的蛋白質(zhì)質(zhì)量比比花生分離蛋白的要少(蛋白質(zhì)質(zhì)量比從原來(lái)蛋白中的70.13%下降到肽粉中13.87%),而氮溶指數(shù)(TCA-NSI)質(zhì)量比從花生分離蛋白中的12.51%上升到79.43%.由此可知,花生分離蛋白的短肽得率比較高,酶解效果好.

表2 花生抗氧化肽粉的組成Tab.2 Main components of peanut antioxidant peptide

2.2 單蛋白酶的篩選結(jié)果

選取6種不同的蛋白酶在其最適的溫度、pH值下對(duì)花生分離蛋白進(jìn)行水解,比較其水解度和清除率可知,無(wú)論是從DPPH清除率還是水解度進(jìn)行考察,Alcalase堿性蛋白酶的酶解效果都較好,其次是胰蛋白酶及木瓜蛋白酶.這3個(gè)蛋白酶中有兩種蛋白酶(Alcalase堿性蛋白酶、胰蛋白酶)感官品質(zhì)表現(xiàn)出淡黃、澄清,而木瓜蛋白酶是微黃,有部分沉淀.結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 不同蛋白酶對(duì)花生分離蛋白的酶解條件及酶解結(jié)果Tab.3 Enzymatic condition and results of hydrolysis of peanut protein isolate with different proteases

2.3 復(fù)合蛋白酶篩選結(jié)果

選取前期單酶實(shí)驗(yàn)酶解效果較好的3種蛋白酶(Alcalase堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶)進(jìn)行兩兩組合實(shí)驗(yàn),并跟單酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果見(jiàn)圖1.由圖1可知,堿性蛋白酶和胰蛋白酶組合酶解效果最好.因此,選取這個(gè)組合作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的復(fù)合酶.

2.4 復(fù)合蛋白酶比例組合篩選結(jié)果

選取堿性蛋白酶和胰蛋白酶作為本次實(shí)驗(yàn)的復(fù)合蛋白酶,配制不同比例的復(fù)合酶,以水解度和清除率作為指標(biāo),從而得出較佳的復(fù)合酶比例.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表4,8號(hào)處理組的水解度和清除率最高,分別達(dá)到18.95%,73.49%,比第二高的7組分別提高了0.19%,0.48%.與單一酶解效果比較,復(fù)合酶中1至9號(hào)所有處理組合的水解度和清除率均高于單一胰蛋白酶處理組,而單一堿性蛋白酶要高于復(fù)合酶2,3,4,5,6處理組.所以本實(shí)驗(yàn)采用的復(fù)合酶比例是第8處理組(8∶2).

表4 堿性蛋白酶和胰蛋白酶不同復(fù)合比例組合對(duì)花生分離蛋白的水解效果Tab.4 Enzymatic results of hydrolysis of peanut protein isolate with combined alcalase and trypsin at different ratios

2.5 復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶水解花生分離蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在復(fù)合酶確定的前提下,影響花生分離蛋白的清除率和DH的主要因素有反應(yīng)溫度、pH值、時(shí)間和酶添加量等,因而單因素實(shí)驗(yàn)分別討論了這幾個(gè)因素對(duì)酶解效果的影響.

2.5.1 風(fēng)味蛋白酶加入量的選擇

在一定條件下,加入復(fù)合蛋白酶,30 min后再加入風(fēng)味蛋白酶.隨著風(fēng)味蛋白酶量的增加,DH和DPPH清除率先增大后減小,結(jié)果見(jiàn)圖2,當(dāng)風(fēng)味蛋白酶加入量(E/S)為2%時(shí),花生分離蛋白水解效果較佳.

圖2 風(fēng)味蛋白酶加入量對(duì)花生分離蛋白水解效果的影響Fig.2 Effect of flavorzyme amount on DH and DPPH free radicals scavenging of peanut protein isolate

2.5.2 風(fēng)味蛋白酶加入時(shí)間的選擇

在一定條件下,復(fù)合蛋白酶加入量(E/S)為2%,再隔一定時(shí)間加入風(fēng)味蛋白酶.隨著加入風(fēng)味蛋白酶時(shí)間的增加,DPPH清除率先減小后增大,而DH一直下降最后趨于平穩(wěn),結(jié)果見(jiàn)圖3.當(dāng)風(fēng)味蛋白酶加入時(shí)間為30 min時(shí),花生分離蛋白水解效果較佳.

圖3 風(fēng)味蛋白酶加入時(shí)間對(duì)花生分離蛋白水解效果的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on DH and DPPH free radicals scavenging with flavorzyme

2.5.3 復(fù)合蛋白酶水解時(shí)間的選擇

根據(jù)前面實(shí)驗(yàn),固定風(fēng)味蛋白酶的酶解條件(加入量為2%,加入時(shí)間為30 min),以復(fù)合酶粗略的酶解條件為基礎(chǔ),改變其中的酶解時(shí)間,選擇8個(gè)時(shí)間段分別考察清除率和水解度兩個(gè)指標(biāo),酶解開(kāi)始30 min后加入風(fēng)味蛋白酶,結(jié)果見(jiàn)圖4.

圖4 時(shí)間對(duì)花生分離蛋白水解效果的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on DH and DPPH free radicals scavenging of peanut protein isolate

由圖4可見(jiàn),酶解液的水解度和清除率均隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加,酶解最初2 h增長(zhǎng)速度極快直至3 h,4～5 h后反應(yīng)逐漸趨于平緩,7～8 h的時(shí)間段里水解度的增長(zhǎng)不大,基本持平,而清除率呈下降趨勢(shì).因此,選擇水解時(shí)間3 h為宜.隨著反應(yīng)產(chǎn)物的增多,酶和底物的有效碰撞減少,系統(tǒng)的pH值也發(fā)生了變化,加之酶的活性逐漸下降,反應(yīng)后期水解度的變化不大.清除率在酶解前期隨著酶解時(shí)間增大逐漸增大,反應(yīng)后期,活性肽可能被進(jìn)一步水解,喪失了氧化活性,造成了清除率的下降.

2.5.4 復(fù)合蛋白酶水解pH值的選擇

根據(jù)實(shí)驗(yàn)1.3.7,固定風(fēng)味蛋白酶的酶解條件(加入量2%,加入時(shí)間30 min),以復(fù)合酶粗略的酶解條件為基礎(chǔ),酶解時(shí)間3 h,選擇8個(gè)不同pH值考察清除率和水解度.分別調(diào)整酶解液pH值為6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,反應(yīng)時(shí)間3 h.pH值為6～7時(shí),酶解液的水解度和清除率增長(zhǎng)率都達(dá)到最高,pH值為7.0～8.5時(shí),增長(zhǎng)比較平緩,從pH值為8.5開(kāi)始,水解度和清除率急速下降.根據(jù)實(shí)際情況,選取pH值8.5為宜,結(jié)果見(jiàn)圖5.

2.5.5 復(fù)合蛋白酶水解溫度的選擇

取樣分別用不同酶解溫度進(jìn)行水解,酶解液在50℃時(shí)水解度和清除率最高,水解度為25.3%,清除率為77.9%.55℃之后隨著溫度的繼續(xù)升高水解度和清除率快速下降,這說(shuō)明隨著反應(yīng)溫度的提高,酶的活性降低,蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率下降,結(jié)果見(jiàn)圖6.

2.5.6 復(fù)合蛋白酶加酶總量的選擇

在確定酶解溫度、pH值、酶解時(shí)間的基礎(chǔ)上,考察6個(gè)加酶量對(duì)水解度和清除率的影響,在酶促反應(yīng)中,底物濃度已達(dá)到使酶飽和的狀態(tài),其反應(yīng)速度將隨酶濃度的變化而變化[9].加酶總量(E/S)在3%時(shí),水解度最高,添加量為1% ～2%的反應(yīng)體系中底物充足,速度較快,添加量在4%以后趨緩,這時(shí)酶與酶之間相互水解,酶有效利用率下降,故選加酶總量為3%,結(jié)果見(jiàn)圖7.

圖5 pH值對(duì)花生分離蛋白水解效果的影響Fig.5 Effect of pH on DH and DPPH free radicals scavenging of peanut protein isolate

圖6 溫度對(duì)花生分離蛋白水解效果的影響Fig.6 Effect of hydrolysis temperature on DH and DPPH free radicals scavenging of peanut protein isolate

圖7 加酶總量對(duì)花生分離蛋白水解效果的影響Fig.7 Effect of enzyme/substrate ratio(E/S)on DH and DPPH free radicals scavenging of peanut protein isolate

2.6 較佳復(fù)合蛋白酶酶解條件的探討

在復(fù)合蛋白酶水解花生分離蛋白的反應(yīng)體系中,參數(shù)有加酶總量、酶解時(shí)間、pH值、水解溫度,采用DPPH自由基清除率(Y1)和水解度(Y2)為優(yōu)化指標(biāo).

2.6.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

綜合考慮各因素對(duì)清除率和水解度的影響,采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[10],對(duì)溫度、反應(yīng)時(shí)間、pH值、加酶總量4因素優(yōu)化設(shè)計(jì),結(jié)果如表5.

表5 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Experimental design and results of Box-Benhnken experimental design

2.6.2 酶解過(guò)程各參數(shù)對(duì)清除率的回歸模型

為了考察各因素對(duì)復(fù)合蛋白酶清除率的影響,以DPPH清除率為考察指標(biāo),利用分析軟件(DESIGN EXPERT 7.0)對(duì)表5的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,以pH值(X1)、水解溫度(X2)、復(fù)合酶添加總量(X3)和酶解時(shí)間(X4)為自變量,DPPH自由基清除率(Y1)為因變量,建立酶解工藝參數(shù)回歸模型,回歸方程為:清除率=79.63+1.37X1-2.16X2+3.86X3-0.30X4+0.67X1X2-0.15X1X3-0.063X1X4+1.87X2X3+0.45X2X4+1.25X3X4-1.08-0.79-4.43-0.63

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表6.

表6 復(fù)合蛋白酶清除率方差分析Tab.6 ANOVA for free radical scavenging rate of hydrolyzed peanut protein isolate with different technological parameters

從表6可以看出,清除率的回歸模型具有高度顯著性(P＜0.000 1),失擬項(xiàng)P=0.114 8＞0.05,不顯著.為0.917 4,說(shuō)明該模型能解釋約92%響應(yīng)值的變化,表明方程擬合程度較好.本試驗(yàn)CV=1.48%,表明試驗(yàn)結(jié)果可靠,在可接受范圍之內(nèi),可以用此模型分析和預(yù)測(cè)復(fù)合酶水解花生分離蛋白各因素對(duì)清除率的影響.

根據(jù)回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知,模型的一次項(xiàng) X1、X2、X3(P＜0.01)影響極顯著,X4(P＞0.05)影響不顯著;交互項(xiàng)X2X3(P＜0.01)影響極顯著,X1X3(P＜0.05)影響顯著;二次項(xiàng)(P＜0.05)影響顯著,(P＜0.01)影響都極顯著,、影響不顯著.由此可以看出,響應(yīng)值的變化復(fù)雜,各個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系.由表6中F值的大小可以判斷各因素對(duì)清除率影響的強(qiáng)弱.由此可知影響因素的主效應(yīng)主次順序?yàn)槊柑砑涌偭浚舅鉁囟龋緋H值＞水解時(shí)間.

2.6.3 酶解過(guò)程各參數(shù)對(duì)水解度的回歸模型

為了考察各因素對(duì)復(fù)合蛋白酶清除率的影響,以DH為考察指標(biāo),利用分析軟件(DESIGN EXPERT 7.0)對(duì)表5的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,以pH值(X1)、水解溫度(X2)、復(fù)合酶添加總量(X3)和酶解時(shí)間(X4)為自變量,水解度DH(Y2)為因變量,建立酶解工藝參數(shù)回歸模型.回歸方程為:DH=25.29-0.39X1+0.24X2-0.40X3+1.39X4-0.29X1X2+0.54X1X3+0.47X1X4-0.18X2X3-0.21X2X4+1.95X3X4-1.15-0.30-0.47-3.16.

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表7.DH的回歸模型具有高度顯著性(P＜0.000 1),失擬項(xiàng)P=0.068 4＞0.05,不顯著.為 0.884 5,表明方程擬合程度較好.本試驗(yàn)CV=3.12%,表明試驗(yàn)結(jié)果可靠,在可接受范圍之內(nèi),可以用此模型分析和預(yù)測(cè)復(fù)合酶水解花生分離蛋白各因素對(duì)DH的影響.

根據(jù)回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知,模型的一次項(xiàng) X4(P ＜0.01)影響極顯著,X1、X2、X3(P ＞0.05)影響不顯著;交互項(xiàng)X3X4(P＜0.01)影響極顯著;二次項(xiàng)、、(P＜0.01)影響都極顯著,影響不顯著.由此可以看出,響應(yīng)值的變化復(fù)雜,各個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系.由表8中F值的大小可以判斷各因素對(duì)水解度影響的強(qiáng)弱.由此可知影響因素的主效應(yīng)主次順序?yàn)樗鈺r(shí)間＞酶添加總量＞pH值＞水解溫度.

2.6.4 花生分離蛋白清除率和DH相關(guān)分析研究

經(jīng)過(guò)spss統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)Y1(清除率)和Y2(DH)之間進(jìn)行相關(guān)線性分析,進(jìn)一步研究清除率和DH之間的線性相關(guān)性,從而確定花生分離蛋白抗氧化性肽的影響指標(biāo),試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8.

從表8可以看出,模型(P=0.167＞0.05)不顯著,表明Y1(清除率)和Y2(DH)之間線性不相關(guān),即清除率大水解度不一定大,水解度大的清除率也不一定大.

表7 花生分離蛋白水解度回歸模型方差分析Tab.7 ANOVA for DH of hydrolyzed peanut protein isolate with different technological parameters

表8 清除率與DH線性相關(guān)方差分析結(jié)果Tab.8 ANOVA for linear correlation between DH of peanut protein isolate and DPPH free radical scavenging rate

為了進(jìn)一步研究清除率與水解度之間的相關(guān)性,在復(fù)合蛋白酶制備花生分離蛋白抗氧化性肽較佳酶解條件下,每隔0.5 h測(cè)定一次清除率和DH(每個(gè)數(shù)據(jù)為3次平行試驗(yàn)均值),畫(huà)出酶解10 h過(guò)程中清除率和DH之間的變化趨勢(shì)圖,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8.從圖8可看出,清除率達(dá)到最大時(shí)DH并沒(méi)達(dá)到最大值,DH先急劇上升后慢慢趨于平緩,最終保持不變.而酶解產(chǎn)物的清除率是先上升到最大值后呈急速下降態(tài)勢(shì),酶解產(chǎn)物的清除率和DH在前3 h內(nèi)具有相關(guān)性,即在酶解過(guò)程前3 h時(shí)之內(nèi),清除率隨著DH值的增大而增大.3 h后,水解度基本保持不變,而清除率急劇下降,8 h后趨于平緩,且這段時(shí)間兩者線性不相關(guān).因此制備花生分離蛋白抗氧化性肽以清除率為第一響應(yīng)指標(biāo),水解度(DH)為輔助指標(biāo),這樣可以制備到清除率最高的抗氧化性肽.

圖8 清除率和水解度的變化趨勢(shì)Fig.8 Changes of DH of peanut protein isolate and DPPH free radical scavenging rate

2.7 工藝參數(shù)的驗(yàn)證

通過(guò)軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析,可得到兩個(gè)最大響應(yīng)值所對(duì)應(yīng)的因素條件,見(jiàn)表9.從表中可知,達(dá)到最大清除率和DH的因素條件并不完全一致,線性不相關(guān),表明兩個(gè)指標(biāo)之間相互制約.結(jié)合前面清除率和DH之間的變化趨勢(shì)圖的分析并綜合考慮可知,優(yōu)化酶解條件為:pH 8.5、溫度49.36℃、酶添加量3.40%、酶解時(shí)間203.59 min.采用上述優(yōu)化轉(zhuǎn)變后的酶解工藝條件,并且進(jìn)行3次平行的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測(cè)得花生分離蛋白抗氧化肽對(duì)DPPH自由基的清除率為80.58%、DH為24.40%.通過(guò)與理論值(表10中花生分離蛋白自由基清除率為80.18%和 DH為24.59%)比較,誤差都在±1%以內(nèi).說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的酶解工藝條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠,根據(jù)建立的模型進(jìn)行預(yù)測(cè)實(shí)踐是可行的.

表9 基于試驗(yàn)編碼值的優(yōu)化條件轉(zhuǎn)化Tab.9 Translation of experimental code to real value of optimum conditions

表10 酶解平行驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.10 Validation results of optimized peanut protein isolate hydrolysis process

3 結(jié) 論

1)通過(guò)比較研究堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶等5種蛋白酶的水解效果,根據(jù)DPPH自由基清除率和水解度兩個(gè)指標(biāo)選取出堿性蛋白酶和胰蛋白在酶添加量比例為8∶2時(shí)做為復(fù)酶配合使用,并且風(fēng)味蛋白酶在水解開(kāi)始30 min后添加酶量2%,酶解效果俱佳.

2)采用Design Expert 8.0.4統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析,建立復(fù)合蛋白酶酶解花生分離蛋白工藝中pH值、酶解溫度、加酶總量和酶解時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率和水解度的數(shù)學(xué)模型.通過(guò)方差和可信度分析表明,模型擬合度較好.

3)在較佳條件下復(fù)合蛋白酶制備花生分離蛋白抗氧化肽過(guò)程中,酶解產(chǎn)物的清除率與水解度在一定范圍內(nèi)呈正或負(fù)相關(guān),即在酶解3 h內(nèi)清除率隨著水解度增大而增大,6 h后隨著水解度增加清除率反而降低.

4)復(fù)合蛋白酶制備花生分離蛋白抗氧化肽的較佳酶解工藝為pH 8.5、溫度49.36℃、酶添加量3.40%、酶解時(shí)間203.59 min.采用優(yōu)化后的酶解工藝條件,進(jìn)行3次平行的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測(cè)得花生分離蛋白抗氧化肽對(duì)DPPH自由基的清除率為80.58%,DH為24.40%.

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