耿勝榮, 廖 濤, 李 新, 鉏曉艷

(湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術研究所/湖北省農(nóng)產(chǎn)品輻照加工中心/湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心,湖北武漢 430064)

輻照是一種利用電離射線與物質(zhì)作用,產(chǎn)生的物理、化學和生物學效應,達到殺蟲滅菌的目的[1].射線的穿透力強和冷殺菌兩個優(yōu)點,尤其適合組織材料、醫(yī)藥和醫(yī)療用品上的消毒滅菌[2-4],保證生物安全性和延長貨架期.目前輻照作為明膠和膠囊滅菌應用已十分廣泛.但是輻照過程中常常產(chǎn)生負效應導致明膠黏度下降、膠囊易碎、溶脹性差的問題.目前關于明膠品質(zhì)劣變的研究在明膠可溶性變差,導致藥品膠囊的藥物溶出率低[5],明膠膜的交聯(lián)改性[6]方面有報道,但膠囊或明膠本身在原料階段輻射滅菌引起的品質(zhì)變化缺乏研究.本實驗以小分子量進口明膠為材料,開展輻照對明膠理化性能與蛋白成分(分子量、分子組成及結(jié)構(gòu)等)的影響,探索劑量與分子量大小、分布和性能的關系,為確定最佳輻射劑量提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

G9382型牛皮明膠,Simga公司生產(chǎn).

1.2 儀器設備

60Co-γ輻照源,湖北省輻照實驗中心;1515型高效液相色譜泵、2690D型分離模塊、2410型折射率檢測器、Ultrahy drogel 2000,250型色譜柱,美國waters公司;Quanta 200型掃描電鏡,荷蘭FEI公司;DSC200F3型示差掃描量熱儀,德國Netzsch公司;TA-XTPlus型質(zhì)構(gòu)儀,英國SMS公司;DYY-12型電泳儀,北京六一儀器廠,50 mL稀釋型烏氏黏度計等.

1.3 輻照處理

明膠用自封口袋包裝,采用動態(tài)懸掛輻照的方式分別照射4～52 kGy,每個劑量樣品附有兩支硫酸亞鐵劑量計跟蹤劑量,平均值作為樣品的吸收劑量.對照不輻照.照射完后立即取樣測定各指標.

1.4 測定方法

1.4.1 特性黏度的測定

取0.6 g明膠,加入11.4 g蒸餾水,室溫溶脹,55℃水浴溶解,配制成初始濃度(c0)為5%的明膠水溶液.此后用蒸餾水逐次稀釋成原濃度的2/3,1/2,1/3和1/4.用0.45 mm烏氏黏度計在37℃下測定不同濃度(c)的樣品流出兩刻度線的時間(t)和蒸餾水流出時間(t0),計算特性黏度[η].

1.4.2 凝膠強度的測定

在文獻[7]的基礎上進行改進,質(zhì)構(gòu)儀測定參數(shù)按美國試驗標準GMIA進行.

1.4.3 熔化溫度及膠凝溫度的測定

在文獻[8]的基礎上進行改進.示差掃描量熱儀的溫度程序：10～55℃,升溫速度5℃/min;55℃恒溫2min;55～10℃,降溫速度5℃/min,5℃恒溫2min,65℃結(jié)束.

1.4.4 分子量大小及分布的測定

在文獻[9]的基礎上進行改進.配制1 000 mL的0.1 mol·dm-3Na2HPO4,其中含8 g NaN3,用 NaH2PO4調(diào)節(jié)pH至8.0,取500 mL作為儲備液.另取500 mL儲備液稀釋至2 000 mL作為淋洗液;進樣量為100 μL,溶劑為 H2O-0.2 mol·dm-3NaNO3,淋洗液流速為0.6 mL/min.標樣為聚乙烯乙二醇,柱子溫度40℃,檢測器溫度40℃.

1.4.5 蛋白組分分布的測定

聚丙烯酰胺凝膠電泳采用15%分離膠和4%濃縮膠,樣品濃度為2 mg/mL,上樣量為20μL.濃縮膠電壓為60 V,分離膠電壓為100 V.考馬斯亮藍R250染色過夜,用脫色液脫色3次.脫色后的膠塊照相保存.

1.4.6 表面形貌分析的測定

采用掃描電鏡進行分析.配制未照射和照射52.7 kGy的明膠10%的水溶液各100 mL,低溫下形成凝膠后,在-80℃冰箱速凍,再凍干,取少量凍干樣品做表面和截面掃描.

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照對明膠黏度的影響

未輻照明膠的特性黏度和相對黏度分別為2 936 mL/g和2.52,輻照后明膠兩種黏度隨劑量的增加快速下降(見圖1).吸收劑量為8.01 kGy的明膠特性黏度和相對黏度分別為對照的93.3%和96.4%,吸收劑量為26.79 kGy的明膠分別為對照的84.2%和92.1%.可見,生產(chǎn)上常用的8 kGy的滅菌劑量,輻照后明膠水溶液的表觀黏度略有下降,當吸收劑量達到26.79 kGy時,應用品質(zhì)受到影響.特性黏度的下降來源于分子的降解,輻射劑量越大,降解程度越大.

2.2 輻照對明膠凝膠強度的影響

圖1 輻射劑量對特性黏度和相對黏度的影響Fig.1 Effect of irradiation dosage on intrinsic viscosity and relative viscosity

未輻照的明膠凝膠強度為141 g,輻照后的明膠凝膠強度有小幅波動,總趨勢為下降的(見圖2).吸收劑量為8.01 kGy時,凝膠強度為153.6 g,較對照有所增加.當吸收劑量為26.79 kGy時,凝膠強度為100 g,為對照的70.9%.據(jù)報道,明膠中的α組分與凝膠強度成正比[10-11].由此可見,輻照降低了明膠中α組分含量,劑量越大,降解程度越大.

圖2 輻射劑量對凝膠強度的影響Fig.2 Effect of irradiation dosage on gel strength

2.3 輻照對明膠熔化和膠凝溫度的影響

明膠是一種熱可逆凝膠,穩(wěn)定這種熱可逆凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的主要作用力是氫鍵.當溫度升高,分子鏈熱運動加強,氫鍵斷開,凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)被破壞.當溫度降低,熔膠體系自發(fā)放熱形成凝膠.明膠水溶液熔膠-凝膠轉(zhuǎn)變臨界溫度點稱為膠凝溫度和熔化溫度[9].圖3為不同輻照劑量明膠熔膠和凝膠溫度變化曲線圖,可見,未輻照明膠熔膠溫度為27.1℃,輻照后明膠的熔膠溫度隨劑量呈下降趨勢.未輻照明膠凝膠溫度為36.2℃,輻照后明膠的凝膠溫度高于對照,范圍在39.8～42.7℃.吸收劑量低于8.01 kGy時,明膠膠凝溫度有小的上升峰,吸收劑量大于8.01 kGy時,明膠膠凝溫度隨劑量的增加呈緩慢上升趨勢.輻照引起明膠的熔膠溫度下降,這說明分子吸熱解鏈熱能降低,明膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)對熱不穩(wěn)定,分子發(fā)生了分解.輻照引起膠凝溫度升高,說明分子自發(fā)形成網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)容易,分子發(fā)生了降解.

圖3 輻射劑量對明膠熔化溫度和膠凝溫度的影響Fig.3 Effect of irradiation dosage on melting point and gel point of gelatin

2.4 輻照對明膠分子量的影響

圖4 為不同劑量輻照后明膠相對重均分子量Mw和相對數(shù)均分子量Mn的變化曲線圖.未輻照的明膠的Mw和Mn分別為36 506和10 861.二者在0～8.01 kGy范圍的吸收劑量有小的上升峰,此后,均隨劑量的增加呈下降趨勢,吸收劑量達到52.7時,二者分別為對照的88.87%和72.18%.這說明,輻照將大分子降解,形成更多種小分子的混合物,劑量越大,降解程度越大,分子量越低.

圖4 輻射劑量對明膠分子量的影響Fig.4 Effect of irradiation dosage on Mw and Mn of gelatin

圖5 為不同劑量輻照明膠的凝膠滲透色譜圖.未輻照明膠(0 kGy)出峰早,峰型高而窄.輻照后明膠出峰晚,峰型矮而寬,并且劑量越大,峰型越寬而矮.這說明分子量的分布隨劑量增加而加大.

2.5 SDS-PAGE分析

圖5 不同劑量輻照后明膠的凝膠滲透色譜圖Fig.5 Molecular weight and distribution of irradiated gelatin

圖6 為0～52.7 kGy輻照明膠的電泳圖.左邊第1個泳道為未輻照明膠,分子量主要分布在5 500 u以上,在3 600 u以下幾乎不含有蛋白組分.輻射劑量逐漸加大,泳道顏色變淺,這說明明膠蛋白各組分在輻照過程中發(fā)生了分解反應,大分子量物質(zhì)含量降低.輻照劑量高于37.91 kGy時,大于25 000 u的物質(zhì)明顯減少,分子量主要分布在25 000～13 000 u,低于3 600 u的小分子含量有少量增加.

圖6 不同劑量輻照后明膠的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of gelatin irradiated by different dosage

2.6 結(jié)構(gòu)分析

明膠先在水中溶脹,再凍干做掃描分析.圖7a、7b分別是未輻照和輻照52.7 kGy明膠放大2 500倍表面圖.前者表面看到有顆粒,而后者表面光滑,成膜性好.這是因為經(jīng)輻照52.7 kGy后,溶脹性差的大分子降解為溶脹性較好的小分子,溶脹后分子排列更整齊,表面更光滑.

圖7 未輻照和輻照52.75 kGy明膠表面SEM圖Fig.7 SEM sperm of gelatin no irradiated(a)and irradiated by 52.7 kGy(b)

3 結(jié) 論

明膠輻射殺菌的同時常導致溶液黏度、凝膠彈性以及成膜性等品質(zhì)下降的問題,很大程度影響了其應用價值.從本研究結(jié)果來看,0～52.7 kGy輻照范圍,由于輻射分解,明膠分子網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)降解,大分子量物質(zhì)含量下降,小分子量物質(zhì)含量增加,平均分子量下降,Mn和Mw范圍為7 839～10 861,32 444～36 506.并且分子量分布變寬,范圍為3.36～4.45.特性黏度和相對黏度降低、凝膠強度降低、熔膠溫度下降和膠凝溫度升高、表面結(jié)構(gòu)更為平滑和整齊.

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