余 瑛，張孝彬，陳玉燕，楊艷紅

(重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

蟲草是一類復(fù)型真菌，其無性型產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有抗菌、抗病毒、抗癌、殺蟲、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗氧化［1］等作用，在醫(yī)藥領(lǐng)域有很大的應(yīng)用潛力。戴氏綠僵菌變種Metarhizium taii var.chongqingensis nov(M.taii var)是一種低海拔地區(qū)蟲草的無性型菌株。本文報(bào)道了M.taii var發(fā)酵產(chǎn)物拮抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA)的初步研究結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

供試菌:M.taii var，由重慶理工大學(xué)楊艷紅分離保存。

病原菌:MRSA標(biāo)準(zhǔn)菌株WHO2、臨床分離的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)共10株，由第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基

1)PDA固體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂 15 g，pH=7.0，去離子水定容至 1 000 mL。

2)細(xì)菌培養(yǎng)基:胰蛋白10 g，酵母粉5 g，氯化鈉 5 g，Ph=7.0，去離子水定容至 1 000 mL。

3)抑菌平板培養(yǎng)基:胰蛋白10 g，酵母粉5 g、氯化鈉5 g，瓊脂30 g，去離子水定容至1 000 mL。

4)生長發(fā)酵培養(yǎng)基:NaNO30.5 g，KCl 0.5 g，蔗糖 30 g，蠶蛹粉 0.5 g，pH=6.5，去離子水定容至1 000 mL。

5)發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10 g，蛋白胨2.5 g，酵母粉 5 g，pH 值為 6.0 ～7.0，去離子水定容至1 000 mL。

1.1.3 主要試劑

蛋白酶K，購自鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 供試菌種的活化

取-80℃冰箱保存的供試菌 M.taii var，在PDA平板上劃線接種，于28℃培養(yǎng)14 d至孢子發(fā)育成熟。

1.2.2 供試菌的發(fā)酵培養(yǎng)

孢子懸液的制備:從PDA平板上刮取孢子，用無菌水重懸成孢子懸液后以4層無菌擦鏡紙過濾孢子液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子，并調(diào)整孢子懸液濃度為109cell/mL。

接種及發(fā)酵:取100 μL孢子懸液接種到100 mL生長培養(yǎng)基中。培養(yǎng)2 d后，按1∶10接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化應(yīng)用正交設(shè)計(jì)法，采用2組變量:發(fā)酵培養(yǎng)基 pH 值為5.5、6.0、6.5、7.0;培養(yǎng)溫度為 25℃、28℃、30℃。發(fā)酵培養(yǎng)3～9 d，每日取發(fā)酵上清2 mL，10 000 r/min離心5 min，取上清進(jìn)行抗WHO2的活性測(cè)定。

1.2.3 病原菌的培養(yǎng)

挑取活化的WHO2或各臨床分離的SA單克隆分別接種于 100 mL細(xì)菌培養(yǎng)基，37℃，250 r/min過夜培養(yǎng)，備用。

1.2.4 抑菌活性測(cè)定

M.taii var發(fā)酵上清拮抗WHO2的活性測(cè)定采用瓊脂擴(kuò)散法［2］。將過夜培養(yǎng)的 WHO2，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)調(diào)整濃度為104個(gè)/mL，用移液槍吸取100 μL菌液，均勻涂布到抑菌平板培養(yǎng)基上。用打孔器在培養(yǎng)基上打孔，孔中加入發(fā)酵上清液150 μL，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中放置培養(yǎng)12 h，測(cè)定抑菌圈直徑大小。

臨床分離的SA對(duì)甲氧西林敏感性測(cè)定結(jié)果由西南醫(yī)院提供。SA對(duì)M.taii var發(fā)酵上清的敏感性采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定。

1.2.5 高溫及蛋白酶K對(duì)M.taii var發(fā)酵上清活性的影響

將發(fā)酵液上清分別在45℃、65℃、85℃、100℃各處理5 min、10 min、15 min，測(cè)定抑菌活性。用未經(jīng)高溫處理的發(fā)酵液上清作對(duì)照。

分別在100 μL發(fā)酵液上清中加入質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為10 mg/mL蛋白酶 K 50μL，37℃各孵育30 min、60 min，測(cè)定抑菌活性。用未加入蛋白酶 K發(fā)酵液上清作對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度及pH對(duì)M.taii var發(fā)酵上清抗菌活性成分表達(dá)的影響

在前期已對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選的基礎(chǔ)上，采用不同pH的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵溫度進(jìn)行培養(yǎng)，提取發(fā)酵上清測(cè)定抑菌活性，結(jié)果(見表1)表明:30℃，pH值為5.5～6.0條件最適合抑菌成分的表達(dá)，該條件下發(fā)酵上清的抑菌活性最先達(dá)到峰值，即發(fā)酵7 d時(shí)抑菌圈直徑達(dá)到3.6 cm，其活性高于其他條件下的發(fā)酵上清。

表1 不同培養(yǎng)溫度、pH條件下M.taii var發(fā)酵上清拮抗MRSA的活性

2.2 高溫對(duì)M.taii var發(fā)酵上清抗菌活性的影響

將M.taii var發(fā)酵上清分別用45℃、65℃、85℃、100℃處理后，測(cè)定其抑菌活性變化，結(jié)果顯示:不同溫度處理后 M.taii var發(fā)酵上清拮抗WHO2的抑菌圈直徑無顯著變化(見圖1)，即M.taii var發(fā)酵上清中的抑菌成分在高溫條件下活性穩(wěn)定。

2.3 蛋白酶K對(duì)M.taii var發(fā)酵上清抗菌活性的影響

在M.taii var發(fā)酵上清中加入蛋白酶K，37℃孵育30 min或60 min后測(cè)定其抑菌活性變化，結(jié)果顯示:處理后的M.taii var發(fā)酵上清拮抗WHO2的抑菌圈大小無顯著變化(見圖2)，即蛋白酶K對(duì)M.taii var發(fā)酵上清中的抑菌成分活性無影響。

2.4 M.taii var發(fā)酵上清對(duì)各臨床分離SA的拮抗作用

測(cè)定M.taii var發(fā)酵上清對(duì)各臨床分離SA的抗菌活性，結(jié)果顯示該發(fā)酵上清對(duì)臨床分離的SA菌株均有拮抗作用，其抑菌圈直徑在3.4～3.6 cm(表2未顯示)，這些被檢測(cè)的SA中有對(duì)甲氧西林耐受菌株即MRSA菌株，也有對(duì)甲氧西林敏感的SA菌株(見表2)。

圖1 M.taii var抑菌成分在高溫處理后的穩(wěn)定性

表2 M.taii var發(fā)酵上清對(duì)臨床分離SA的抗菌活性

圖2 M.taii var發(fā)酵上清抑菌成分經(jīng)蛋白酶K消化后的活性

3 討論

SA是引起細(xì)菌性食物中毒和化膿感染最常見的病原菌之一。自19世紀(jì)40年代青霉素問世以來，SA引起的感染性疾病受到較大的控制。但隨著青霉素的廣泛使用，有些SA產(chǎn)生了一種能水解β-內(nèi)酰胺環(huán)的酶，可使青霉素?zé)o效，即產(chǎn)生了耐藥性。隨后推出的甲氧西林在臨床使用2年后就出現(xiàn)了耐甲氧西林的菌株MRSA［3］。目前，MRSA已成為院內(nèi)感染的重要病原菌之一。耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，使得MRSA治療藥物變得日益匱乏，尋找新的抗MRSA活性物質(zhì)來源是進(jìn)行新型抗MRSA藥物研發(fā)的工作基礎(chǔ)。本研究研究證實(shí)M.taii var發(fā)酵上清對(duì)臨床分離的不同MRSA菌株及普通SA菌株都有抗菌活性，表明M.taii var產(chǎn)生的抗菌成分與甲氧西林有不同的抗菌機(jī)制，該活性物該抗菌成分還有耐高溫和抗蛋白酶K水解的特性，在pH值為5.6～6.0，溫度為30℃時(shí)表達(dá)活性最高。已有的研究結(jié)果顯示綠僵菌、白僵菌等真菌的次生代謝產(chǎn)物中含有一種結(jié)構(gòu)為環(huán)肽的綠僵菌素(destruxins，Dtxs)［4-5］，具有抗菌、抗蟲、抗腫瘤、抗炎癥、抗骨質(zhì)疏松、免疫抑制等多種活性［6］，Dtxs結(jié)構(gòu)均由一個(gè)α-羥酸和5個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，不同菌株來源的Dtxs的α-羥酸類型、N-甲基化修飾、氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)有所不同，均有耐高溫、抗蛋白酶水解的特性［7］。M.taii var抗MRSA是否含有與先前報(bào)道的DTXs類似的結(jié)構(gòu)仍需進(jìn)一步研究。

［1］焦彥朝，梁宗琦，劉愛英.蟲草生物活性物質(zhì)研究概況［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，1990(3)：53-58.

［2］周長林.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)與指導(dǎo)［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2008.

［3］Jensen J U S，Jensen E T，Larsen A R，et al.Control of a methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)outbreak in a day-care institution［J］.Journal of Hospital Infection，2006，63(1)：84-92.

［4］Peng K C，Huang H S，Teng Y M，et al.Circular dichroism analysis of destruxins from Metarhizium anisopliae O-riginal Research Article［J］.Journal of Biochemical and Biophysical Methods，2005，62(1)：41-50.

［5］Morais-Urano R P，Chagas A C S，Berlinck R G S，et al.Acaricidal action of destruxins produced by a marine-derived Beauveria felina on the bovine tick Rhipicephalus(Boophilus)microplus［J］.Experimental Parasitology，2012，132(3)：362-366.

［6］Sarabia F，Chammaa S，Sánchez-Ruiz A，et al.Chemistry and biology of cyclic depsipeptides of medicinal and biological interest［J］.Curr Med Chem，2004(11)：1309.

［7］Asai T，Yamamoto T，Chung Y M，et al.Aromatic polyketide glycosides from an entomopathogenic fungus［J］.Cordyceps indigotica Tetrahedron Letters，2012，53：277-280.