郭嘉亮， 劉兆祥， 巢 偉， 孫平華

(暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632)

上世紀(jì)末，科學(xué)家證實(shí)細(xì)菌之間存在著信息交流(cell-cell signaling or intercellular communication)，細(xì)菌能通過(guò)信息分子的濃度來(lái)感知其數(shù)量，從而誘發(fā)一些從量變到質(zhì)變的生理過(guò)程，如毒性基因的表達(dá)，細(xì)菌的群游和生物膜 (biofilms，BF)的形成等等，細(xì)菌之間的這種“語(yǔ)言”被科學(xué)家Fuqua稱為群體感應(yīng) (quorum sensing，QS)［1］.革蘭氏陰性菌的群體效應(yīng)一般都是由LuxR/I型群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控，并以?；呓z氨酸內(nèi)酯類分子(acyl-homoserine lactone，AHL)作為自誘導(dǎo)劑 (autoinducer，AI)［2］.目前，一些呋喃以及呋喃酮類化合物 (Furanones)被證實(shí)了具有良好的群感效應(yīng)的拮抗作用，可以有效抑制生物膜的形成［3］.研究揭示抗生素耐藥問(wèn)題與致病菌在人體內(nèi)以生物膜的方式生長(zhǎng)密切相關(guān)［4］，而且超過(guò)80%的微生物感染由細(xì)菌的生物被膜引起，如何干擾病原菌的QS系統(tǒng)來(lái)減弱動(dòng)植物病原細(xì)菌的致病性已成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)［5］.

呋喃與吡咯無(wú)論大小、形狀都相似，兩者互為生物電子等排體，而且五元含氮雜環(huán)化合物由于具有廣泛的生物活性而備受重視，故吡咯酮可能是比呋喃酮更有潛力的群體感應(yīng)抑制劑的先導(dǎo)化合物.目前國(guó)內(nèi)未見吡咯酮作為QS抑制劑在該領(lǐng)域中的應(yīng)用，國(guó)外的相關(guān)研究和報(bào)道也非常少，僅限于吡咯二酮類化合物［6］.因此，本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性通過(guò)設(shè)計(jì)合成系列2(5H)-吡咯酮類目標(biāo)化合物(反應(yīng)流程見圖1、2)，并且觀察形態(tài)學(xué)上它們對(duì)生物被膜結(jié)構(gòu)的破壞及清除作用，初步實(shí)驗(yàn)表明，溴代2(5H)-吡咯酮對(duì)革蘭氏陰性菌PA的生物膜形成具有明顯抑制作用.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

X-6型顯微熔點(diǎn)儀;Bruker-AV300/400 MHz型核磁共振儀;PE CHNS/O EA2400Ⅱ型元素分析儀;Thermo Finnigan LCQ adwantage型質(zhì)譜儀.TLC采用硅膠HF254，柱層析采用100～200目硅膠(青島海洋化工廠).所用試劑均為分析純.銅綠假單胞菌(由暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院惠贈(zèng))，SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠);熱場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡SEM(Hitachi S-3000N)，聚氯乙烯吸痰管(上海上醫(yī)康鴿醫(yī)用器材有限公司);戊二醛 (Sigma);LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L和NaCl 10 g/L，MHB液體培養(yǎng)基:馬-欣二氏基質(zhì)21 g/L;生理鹽水:質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%NaCl.以上培養(yǎng)基都經(jīng)過(guò)121℃高壓滅菌備用.

1.2 合成部分［7］

(1)化合物 2a:將化合物 1a(60.3 g，0.46 mol)和200 mL HOAc混合置于500 mL三口圓底燒瓶中，一邊攪拌，一邊在冰浴下滴加 (49.2 g，0.53 mol)NaNO2和60 mL去離子水所配成的溶液，控制滴加速度使反應(yīng)溫度維持在8～12℃.滴加完畢后溫?zé)嶂潦覝?，靜置過(guò)夜.得到橙紅色油狀液體2a.TLC 檢測(cè)呈一個(gè)單點(diǎn) (VEtOAc∶Vpetroleumether=1∶2)，Rf值約為 0.4.1H NMR(CDCl3/TMS，400 MHz):δ 1.33(t，3H，J=7.5Hz)，2.05(s，3H)，2.39(s，3H)，4.35(q，2H，J=7.5Hz)，9.77(s，1H，NH).同樣方法得到2b，2c.

(2)化合物4a:向化合物2中加入乙酰丙酮(52.2 g，0.52 mol)，劇烈攪拌下分批加入 Zn 粉(67.5 g，1.03 mol)，冰浴控制反應(yīng)溫度 50 ～60℃.加完后將混合物攪拌2 h，加熱回流24 h，趁熱將反應(yīng)物傾倒入水中，冷卻析出固體，體積分?jǐn)?shù)95%EtOH重結(jié)晶，真空干燥，得純白色晶體4a(76.5 g，80%)，mp.143 ～ 145 ℃.1H NMR(CDCl3/TMS，400 MHz):δ 1.38(t，3H，J=7.5 Hz)，2.45(s，3H)，2.53(s，3H)，2.59(s，3H)，4.35(q，2H，J=7.5 Hz)，9.34(brs，1H，NH).同樣方法得到 4b，4c.4b:白色晶體，1H NMR(CDCl3/TMS，300 MHz):δ 1.34(t，3H，J=7.5 Hz)，2.24(s，3H)，2.30(s，3H)，4.38(q，2H，J=7.5 Hz)，5.76(s，1H)，9.02(brs，1H，NH).4c:淡黃色晶體，1H NMR(CDCl3/TMS，400 MHz):δ 2.24(s，3H)，2.30(s，3H)，3.82(s，3H)，5.79(s，1H)，8.75(s，1H，NH).

(3)化合物5a:配有攪拌子和導(dǎo)氣管的500 mL三口圓底燒瓶中加入300 mL乙二醇，鼓入N2，劇烈攪拌下依次加入化合物4a(76.5 g，0.38 mol)和80%的水合肼 (25 g，0.5 mol)，在油浴下 (120℃)加熱至沸騰，回流2 h，改成蒸餾裝置除去水分，冷卻至室溫后，加入 KOH(64 g，0.12 mol)，改成回流裝置并回流3 h.然后一邊反應(yīng)一邊收集105～160 ℃ /760 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)的餾分，少量水洗，3×45 mL體積無(wú)水Et2O萃取，無(wú)水Mg-SO4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去Et2O后進(jìn)行柱色譜分離，得到黏稠黃色液體 5a(38 g，84%).1H NMR(CDCl3/TMS，400 MHz):δ 1.09(t，3H，J=7.2Hz)，2.03(s，3H)，2.13(s，3H)，2.36(q，2H，J=7.2 Hz)，6.34(s，1H)，7.41(s，NH).

(4)化合物6a:化合物5a(38 g，0.31 mol)放入配有攪拌子、溫度計(jì)和導(dǎo)氣管的500 mL三口圓底燒瓶中，鼓入 N2，劇烈攪拌下依次加入100 mL MeOH，40 mL H2O，升溫至50℃，攪拌片刻后，在冷凝管上放置滴液漏斗，分次滴加20.5 mL體積分?jǐn)?shù) 30%H2O2(38 mL，11.40 g，0.34 mol)控制溫度不超過(guò)60℃，滴加完畢后在50℃下攪拌3 h，再回流2 h，并冷卻至室溫.加入8 g K2CO3和18 mL H2O所配成的溶液，攪拌過(guò)夜.然后加入100 mL H2O洗，再用CH2Cl2萃取至無(wú)色，水層用濃HCl調(diào)pH值至中性，再繼續(xù)進(jìn)行萃取，合并有機(jī)層，用飽和食鹽水洗，無(wú)水MgSO4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到黃棕色油狀物6a，TLC 檢測(cè) (VEtOAc∶Vpetroleumether=2∶1)，Rf值為 0.65.1H NMR(CDCl3/TMS，400 MHz):δ 0.99(t，3H，J=7.5 Hz)，1.15(d，3H，J=6.8 Hz)，1.67(s，3H)，2.09(q，2H，J=7.4 Hz)，3.95(q，1H，J=6.8 Hz)，7.72(s，NH);MS(ESI)m/z 140.2［M+H］+.6b:白色固體，1H NMR(CDCl3/TMS，400 MHz):δ 1.27(d，3H，J=7.5 Hz)，1.88(s，3H)，4.13(q，1H，J=7.5 Hz)，6.40(s，1H，NH)，6.64(s，1H);MS(ESI)m/z 112.2［M+H］+.

(5)化合物7a:配有溫度計(jì)和導(dǎo)氣管的三口圓底燒瓶中加入化合物6a(13.5 g，97 mmol)和無(wú)水EtOAc(150 mL)，鼓入N2，攪拌10 min，緩慢滴加Br2(31 g，20 mmol)，控制溫度不超過(guò)55℃.然后回流15 min，冷卻至室溫.EtOAc層先后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%(3×30 mL)及10%(3×30 mL)NaHCO3進(jìn)行洗滌.棕色沉淀析出在分液漏斗里，將其過(guò)濾并以H2O和冷EtOAc洗滌.合并EtOAc部分，H2O(3×10 mL)和飽和食鹽水 (20 mL)洗滌，無(wú)水Mg-SO4干燥.旋干溶劑，得紅棕色油狀物，柱色譜分離得到淺黃色固體7a(8 g，45%).1H NMR(CDCl3/TMS，400 MHz):δ 1.16(t，3H，J=7.5 Hz)，1.86(s，3H)，2.40(q，2H，J=7.5 Hz)，5.91(s，1H)，7.52(s，NH);MS(ESI)m/z 216.2 and 218.2［M+H］+.同樣方法得到7b:白色固體 (15 g，60%)，TLC 檢測(cè) (VEtOAc∶Vpetroleumether=1∶2)，Rf值為 0.65.1H NMR(CDCl3/TMS，300 MHz):δ 1.15(t，3H，J=7.5 Hz)，1.84(s，3H)，2.73(q，2H，J=7.5 Hz)，7.33(s，NH);13C NMR(CDCl3/TMS，300 MHz)δ 9.11，14.05，20.01，74.26， 133.78， 140.02， 146.24， 170.27;MS(ESI)m/z 296.4 ［M+H］+;Anal.Calcd for Found:(C8H9Br2NO)C:32.57%;H:3.08%;N:4.75%;S:0%);Found:C，31.73%;H，2.70%;N，4.56%;S，0%.

(6)化合物8:黃棕色固體，空氣中不穩(wěn)定，TLC檢測(cè)呈一個(gè)單點(diǎn) (VEtOAc∶Vpetroleumether=1∶3)，Rf值為 0.60.MS(ESI)m/z 184.2 and 186.2［M+H］+.

(7)化合物 9:化合物4a(10.43 g，0.71 mol)溶于100 mL無(wú)水EtOH 中，加入11.42 g Zn粉，強(qiáng)烈攪拌，N2保護(hù)下快速滴加70 mL濃HCl，使反應(yīng)溫度達(dá)到60℃，并維持至Zn粉消耗完全，將反應(yīng)物傾倒入200 g碎冰中，析出粗產(chǎn)品，過(guò)濾，體積分?jǐn)?shù) 95% EtOH 重結(jié)晶，得白色晶體 (5.15g，52.9%).1H NMR(CDCl3/TMS，400 MHz):δ 1.04(t，3H，J=7.5 Hz)，1.34(t，3H，J=6.8 Hz)，2.20(s，3H)，2.27(s，3H)，2.38(q，2H，J=6.8 Hz)，4.29(q，2H，J=7.5 Hz)，8.66(s，NH).

(8)化合物 10a:將化合物 4(10.43 g，0.71 mol)，NaOH 40 g，體積分?jǐn)?shù)95%EtOH 80 mL，H2O 10 mL充分混合置于250 mL三口圓底燒瓶中，回流4 h，旋蒸去掉EtOH，并室溫冷卻.一邊劇烈攪拌，一邊滴加稀釋的鹽酸，調(diào)節(jié)pH值少于1，固體析出，抽慮去除溶劑，真空干燥過(guò)夜，得到紫色固體(5 g，62.3%).1H NMR(DMSO，400 MHz):δ 2.38(s，3H)，2.48(s，3H)，2.50(s，3H)，11.68(s，NH)，12.38(s，NH).10b:紫色固體，1H NMR(CDCl3/TMS，300 MHz):δ 2.26(s，3H)，2.34(s，3H)，5.84(s，1H)，8.87(s，1H，NH)，11.0(s，1H);MS(ESI)m/z 140.07［M+H］+.

(9)化合物11:在溶有10 g化合物10a的100 mL MeOH中，加入10 mL H2O，強(qiáng)烈攪拌，在N2保護(hù)下回流24 h，過(guò)濾，用CHCl3萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去掉溶劑，得到紅棕色油狀物，進(jìn)行柱色譜分離純化.得到紫色固體 (5.14 g，70%).1H NMR(CDCl3/TMS，300 MHz):δ2.29(s，3H)，2.40(s，3H)，2.50(s，3H)，6.42(s，1H)，8.45(s，NH);13C NMR(CDCl3/TMS，300 MHz)δ 14.20，15.69，31.25，115.61，121.02，121.17，136.80，196.52;MS(ESI)m/z 138.3 ［M+H］+;Anal.Calcd for Found:(C8H11NO)C:70.04%;H:8.08%;N:10.21%;S:0%);Found:C， 69.79%;H，8.08%;N，10.47%;S，0%.

(10)化合物 13a:將化合物 12a(0.36g，2 mmol)，醋酸銨 (0.77g，10 mmol)，10 mL HOAc混合，加熱回流36 h，冷卻到室溫，EtOAc(3×100 mL)萃取，并加入飽和NaHCO3溶液直至無(wú)氣泡產(chǎn)生為止，合并有機(jī)相，無(wú)水Na2SO4干燥、過(guò)濾，旋干溶劑，柱色譜分離 (VEtOAc∶Vpetroleumether=1∶10)，分別得到 13a(0.05 g，產(chǎn)率 56.0%).化合物 13a:1H NMR(CDCl3/TMS，300 MHz):δ 5.36(s，1H)，6.32(dd，J=1.5 Hz，5.7 Hz，1H)，7.00(dd，J=1.4 Hz，5.6 Hz，1H)，9.16(s，NH);MS(ESI)m/z 174［M+H］+;同樣方法得到化合物13b:1H NMR(CDCl3/TMS，300 MHz):δ 5.30(s，1H)，7.12(s，1H)，9.00(s，NH);MS(ESI)m/z 251.8 and 253.7 ［M+H］+.1.3 掃描電鏡實(shí)驗(yàn)［8］

將PA接種于LB培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜，取菌液離心，無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，再用生理鹽水配成0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn) (細(xì)菌數(shù)約為5×108-9CFU/mL)的菌懸液.然后將菌懸液用生理鹽水稀釋50倍.將BF載體放入盛有5 mL菌懸液的試管內(nèi)，37℃恒溫培養(yǎng)，分別培養(yǎng)3、5、7 d，形成不同階段下的BF.

另取試管將BF載體放入盛有5 mL菌懸液的試管內(nèi)，37℃恒溫培養(yǎng)，分別于第3、5、7天向其中加入樣品和蒸餾水，繼續(xù)37℃ 恒溫培養(yǎng)20 h.

以上實(shí)驗(yàn)組別每隔兩天更換一次培養(yǎng)基，加藥時(shí)確保試管中藥物濃度前后一致.附著BF的載體經(jīng)滅菌生理鹽水沖洗去掉浮游菌后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛固定，依次用體積分?jǐn)?shù)50%、70%、80%、90% 酒精各脫水1次，然后用100%酒精脫水2次，醋酸異戊酯脫水2次，每次均為5 min，CO2冷凍干燥5 h.載體表面在真空條件下鍍金粉，SEM觀察，確認(rèn)BF形成.

2 結(jié)果與討論

2.1 Wolff-Kishner還原

化合物4的3位上的羰基還原得到所需的亞甲基.但由于吡咯類化合物遇酸容易聚合，因此無(wú)法使用克萊門森(Chemmensen)還原法.這里使用了Wolff-Kishner還原法，利用肼 (聯(lián)氨)作為還原劑，其要點(diǎn)是以水合肼與醛酮等成腙，然后在高沸點(diǎn)水溶性溶劑(這里是乙二醇)中常壓將腙分解為烴.與克萊門森還原法相比較，本法更為適合，具體優(yōu)點(diǎn)有:①適合酸敏感而對(duì)堿穩(wěn)定的醛酮的還原;②副產(chǎn)物少，產(chǎn)率良好，本系列化合物的產(chǎn)率均在70%以上;選擇性還原羰基，碳碳雙鍵不受影響，不會(huì)還原到吡咯上的雙鍵，故非常適合此處應(yīng)用.此外，水解產(chǎn)生的醛酮在強(qiáng)堿存在下被還原為醇，產(chǎn)生大量副產(chǎn)物.因而分解腙之前要除盡水，可以通過(guò)增加肼量抑制副反應(yīng)發(fā)生.

2.2 掃描電鏡觀察結(jié)果

經(jīng)過(guò)在LB液-吸痰管系統(tǒng)中進(jìn)行培養(yǎng)，黏液型銅綠假單胞菌在培養(yǎng)第1天時(shí)開始黏附;培養(yǎng)3 d與5 d在吸痰管上銅綠假單胞菌的黏附和細(xì)菌外物質(zhì)的堆積隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，肉眼觀察，BF被染成黑褐色棉絮狀，分布不均勻.培養(yǎng)5 d形成的成熟BF比培養(yǎng)3 d形成的早期 BF明顯稠厚，7 d后的BF最為成熟.

通過(guò)在SEM下進(jìn)行觀察，空白對(duì)照組第3天形成早期BF(圖1A，B)，第5天形成成熟的大片狀生物被膜，細(xì)菌被濃稠的黏液樣物質(zhì)包裹(圖1C).BF在載體表而呈片狀分布，BF內(nèi)細(xì)菌呈短桿狀，菌體長(zhǎng)短不一，彼此聚集成堆，周圍有凹凸不平的濃厚黏液狀物質(zhì)緊密包繞，第7天生物被膜更加稠厚，呈菜花狀的立體結(jié)構(gòu)，細(xì)菌借助這些濃厚的黏液狀物質(zhì)連接成大片BF，大部分細(xì)菌都被包裹在被膜層中(圖1D).成熟BF的結(jié)構(gòu)較早期BF致密.

圖1 載體在PA懸液中培養(yǎng)3～7 dFig.1 Carriers being cultivated for 3 d-7 d in PA suspending

分別加入各種藥物進(jìn)行作用，發(fā)現(xiàn)加入藥物7a，8a，8b等的試管明顯不如空白組和其他組混濁，在載體周圍的BF也明顯少于空白組，黑褐色棉絮狀也很少.在SEM下觀察發(fā)現(xiàn)，被這幾個(gè)藥物處理的樣品，在BF載體表面觀察到有少量BF包裹的細(xì)菌群體，菌體清晰可見，細(xì)菌形態(tài)保持短桿狀，但菌體間纖維樣黏液物質(zhì)顯著減少(圖2 A).尤其是對(duì)培養(yǎng)3 d時(shí)間的初期生物膜，溴代吡咯酮7a，8a，8b都能明顯破壞BF的結(jié)構(gòu).

具體以7a對(duì)初期BF的作用為例:在細(xì)菌培養(yǎng)3 d(形成初期BF)，加入7a并培養(yǎng)20 h，可見細(xì)菌輕微群聚，形成一個(gè)個(gè)小的菌落，菌絲之間存在少量黏液樣物質(zhì)，生物被膜很薄一層覆蓋在上面，并未產(chǎn)生大片厚厚致密的結(jié)構(gòu)(圖2 B，C).從形態(tài)學(xué)上說(shuō)明吡咯酮化合物7a對(duì)BF結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了明顯的抑制和破壞作用.然而細(xì)菌培養(yǎng)5 d后，加入藥物7a后BF只是變薄、結(jié)構(gòu)疏松，受到的影響明顯減少.說(shuō)明在BF成熟后，即使是對(duì)BF有抑制作用的藥物7a，8a，8b也很難滲透進(jìn)入成熟BF層(圖2 D).這可能是由于BF成熟后，形成具有協(xié)調(diào)性、功能性和高度結(jié)構(gòu)性的膜狀復(fù)合物，藥物很難進(jìn)入其中.

圖2 載體在含7a的PA懸液中培養(yǎng)20 h的情況Fig.2 Carriers being cultivated for 20h PA suspending which contained 7a

實(shí)驗(yàn)表明吡咯酮類化合物均可能能破壞PA早期及成熟BF，在體外均能明顯抑制PA在固體表面的黏附力.但是，一旦細(xì)菌生物膜生長(zhǎng)成熟，即使有很強(qiáng)抑菌活性的藥物也很難起到很好的效果，這體現(xiàn)了抗生素耐藥的一個(gè)重要原因.另一方面，小分子吡咯和未經(jīng)溴代的吡咯酮基本上沒(méi)有抑菌活性，唯獨(dú)溴代的吡咯酮卻有著特殊的作用，尤其是7a，與大量報(bào)道的呋喃酮相比較，雖不能直接抑制革蘭氏陰性菌PA，但能明顯抑制PA的群聚，并抑制其BF形成，其確切的作用機(jī)理還有待更深入的研究，但很可能與溴原子的活性特點(diǎn)相關(guān).

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