隗黎麗,吳華東,熊六鳳

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江西南昌330045)

柱狀黃桿菌對(duì)草魚TLRs基因表達(dá)水平的影響

隗黎麗,吳華東,熊六鳳

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江西南昌330045)

用柱狀黃桿菌Flavobacterium columnareG4株感染草魚Ctenopharyngodon idella,分別在感染1、4、7 d后提取感染組和對(duì)照組草魚鰓、脾臟、肝臟、腸道和頭腎5種組織的總RNA,并采用半定量RT-PCR方法檢測(cè)不同組織中Toll樣受體3(TLR3)、Toll樣受體7(TLR7)和Toll樣受體22(TLR22)3個(gè)抗病毒免疫基因的表達(dá)變化。結(jié)果表明:注射柱狀黃桿菌7 d后,TLR3在草魚鰓、肝臟、腸道和頭腎4種組織中的表達(dá)顯著上調(diào) (P＜0.05);注射柱狀黃桿菌4 d和7 d后,TLR7和TLR22在5種組織中的表達(dá)均顯著上調(diào)(P＜0.05);而注射柱狀黃桿菌1 d后,TLR22在鰓、脾臟和肝臟組織中的相對(duì)表達(dá)量就顯著上調(diào) (P＜0.05)。研究表明,TLR3、TLR7和TLR22基因在機(jī)體應(yīng)對(duì)細(xì)菌感染的免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用。

草魚;柱狀黃桿菌;Toll樣受體基因;基因表達(dá)

草魚Ctenopharyngodon idella是中國(guó)重要的淡水魚類養(yǎng)殖品種之一,具有生長(zhǎng)快、對(duì)飼料蛋白需求低、肉質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)。隨著養(yǎng)殖密度的增大和養(yǎng)殖環(huán)境的惡化,草魚細(xì)菌性爛鰓病頻繁暴發(fā),造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。爛鰓病的病原菌為柱狀黃桿菌Flavobacterium columnare,主要危害魚苗和魚種,死亡率非常高,尤以草魚為甚[1]。免疫防治是當(dāng)前魚類病害最理想的控制手段[2],因此,對(duì)魚類免疫相關(guān)的基礎(chǔ)研究顯得尤為重要。魚類在受病菌侵染時(shí),自身通過一系列信號(hào)傳遞啟動(dòng)抗病防御系統(tǒng),有序地引發(fā)一系列免疫系統(tǒng)的變化,產(chǎn)生抵抗作用,這一切都源于免疫基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,因此,研究免疫相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),有助于認(rèn)識(shí)抗病的分子機(jī)理。研究發(fā)現(xiàn),Toll樣受體 (Toll-like receptors,TLRs)作為一類模式識(shí)別受體 (pattern recognizing receptor,PRR),在免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[3]。TLR可通過識(shí)別外源性微生物,啟動(dòng)先天性免疫反應(yīng),清除侵入的病原微生物[4],其最突出的生物學(xué)功能是促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放,從而引發(fā)炎癥反應(yīng) (inflammation)[5]。Toll樣受體首次在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并被報(bào)道以來,在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了至少13種TLR家族成員,在水產(chǎn)動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)了幾十種TLR家族成員,其中一些為魚類所特有的TLR家族成員[6]。本研究中,作者采用半定量RT-PCR方法,對(duì)柱狀黃桿菌引起的草魚Toll樣受體3(TLR3)、Toll樣受體7(TLR7)和Toll樣受體22(TLR22)基因在不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)分析,旨在探索草魚對(duì)柱狀黃桿菌的免疫反應(yīng)規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

柱狀黃桿菌G4株由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所魚類免疫學(xué)與寄生蟲實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng),該菌的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基配方參考文獻(xiàn) [7]中的方法。

試驗(yàn)用草魚于2011年1月購(gòu)買于江西省新建縣一漁場(chǎng),體質(zhì)量為15～20 g。將購(gòu)買的草魚在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng),每日投喂一次商品顆粒飼料,水溫保持在25℃左右。選取體表完整、健康的暫養(yǎng)草魚,分別置于玻璃缸 (100 cm×60 cm×50 cm)中飼養(yǎng)。

將草魚分為試驗(yàn)組和對(duì)照組,試驗(yàn)組魚經(jīng)胸腔注射柱狀黃桿菌G4株 (1.0×107cfu/mL)100 μL,對(duì)照組魚注射滅菌的PBS(0.1 mol/L,pH 7.2)。經(jīng)誘導(dǎo)1、4、7 d后取樣,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取4條魚,分別取鰓、頭腎、脾臟、肝臟和腸道組織,用于提取RNA。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 用Trizol(Invitrogen)提取各組織的總RNA。各組織樣品經(jīng)液氮冷凍后加入1 mL的Trizol,再用勻漿器進(jìn)行勻漿,勻碎后,倒入無RNase的離心管中,室溫下靜置10 min,離心(12 000 g,10 min,4℃);取上清,加入200 μL的氯仿,劇烈搖動(dòng)15 s,室溫靜置3 min,離心(12 000 g,15 min);再取上清,轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中,加入500 μL的異丙醇,混勻后,室溫靜置10 min,離心 (10 000 g,10 min,4℃);去掉上清,用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇洗滌沉淀,離心(7 500 g,5 min,4℃);最后加入體積分?jǐn)?shù)為100%的乙醇,于-80℃下保存?zhèn)溆谩Ｓ?2 g/L TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量。

1.2.2 cDNA第一鏈的合成 取制備的RNA樣品,用20 μL DEPC水溶解,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定每個(gè)RNA樣品的濃度。取5 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。25 μL反轉(zhuǎn)錄體系中加入5 μg總RNA模板,再加入1 μL Oligo(dT)18,于 70℃下反應(yīng)5 min,冰上冷卻,離心;然后加入 5×Reaction Buffer 4 μL,Ribolock TM Ribonuclease Inhibitor 1 μL,10 mmol/L dNTP mix 2 μL,RevertAidTMMMuLV Reverse Transcriptase 1 μL;最后再加入DEPC水使反應(yīng)體積達(dá)到25 μL。于42℃下反應(yīng)60 min,反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物分裝,于-20℃下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 用RT-PCR法檢測(cè)TLRs mRNA的相對(duì)表達(dá) 本試驗(yàn)中草魚TLR3、TLR7和TLR22基因的引物設(shè)計(jì)分別參考文獻(xiàn) [8-10]中的方法,詳見表1。以草魚cDNA為模板,用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。20 μL反應(yīng)體系中包含1.0 μL cDNA模板,正反向PCR引物各0.5 μL(10 μmol/L),0.5 μL dNTP(10 μmol/L),2.5 μL 10 ×Buffer,0.2 μL ExTaqE (TaKaRa公司產(chǎn)品),加滅菌水補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)程序如下:94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s,58℃下退火30 s,72℃下延伸40 s,共進(jìn)行25～45個(gè)循環(huán);最后在72℃下延伸5 min,為避免擴(kuò)增達(dá)到平臺(tái)期,分別用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)25、30、35、40個(gè)循環(huán)時(shí)的擴(kuò)增產(chǎn)物,最后選擇最佳的循環(huán)數(shù)。本試驗(yàn)中PCR產(chǎn)物用EB染色[11],用12 g/L TAE瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,并用凝膠電泳顯像儀拍照。

表1 目的基因及內(nèi)參基因的引物Tab.1 Primers of target and internal control genes

1.3 數(shù)據(jù)處理

用凝膠圖像分析軟件Quantity One 4.62對(duì)所獲得的TLRs 3個(gè)基因及β-actin進(jìn)行光密度分析。各目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量以目的基因光密度值與內(nèi)參基因β-actin光密度的比值表示。試驗(yàn)數(shù)值均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 11.5進(jìn)行單因素方差分析,用t檢驗(yàn)法進(jìn)行組間多重比較,以P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 TLR3 mRNA在草魚各組織中的表達(dá)變化

從圖1可見:注射后各時(shí)間點(diǎn),TLR3基因在對(duì)照組和試驗(yàn)組草魚各組織中均能表達(dá),注射柱狀黃桿菌1 d和4 d后,TLR3基因在草魚鰓、脾臟、肝臟、腸道和頭腎5種組織中的表達(dá)變化不明顯,但注射7 d后,TLR3基因在5種組織中的表達(dá)均呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì);除脾臟外,TLR3基因在其他4種組織中的表達(dá)均顯著上調(diào) (P＜0.05),其中TLR3基因在腸道中的表達(dá)變化最大,比對(duì)照組升高了2.38倍。

2.2 TLR7 mRNA在草魚各組織中的表達(dá)變化

從圖1可見:注射后各時(shí)間點(diǎn),TLR7在對(duì)照組和試驗(yàn)組草魚各組織中均能表達(dá),注射柱狀黃桿菌4 d和7 d后,TLR7在5種組織中的表達(dá)均較對(duì)照組顯著上調(diào) (P＜0.05),其中,TLR7在鰓組織中的表達(dá)變化最大,比對(duì)照組升高了3.09倍;注射柱狀黃桿菌1 d后,TLR7在腸道和頭腎組織中的也呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì) (P＜0.05)。

2.3 TLR22 mRNA在草魚各組織中的表達(dá)變化

從圖1可見:注射后各時(shí)間點(diǎn),TLR22在對(duì)照組和試驗(yàn)組草魚各組織中也均能表達(dá),注射柱狀黃桿菌不同時(shí)間后,TLR22在5種組織中的表達(dá)均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),尤其是在注射柱狀黃桿菌4 d和7 d后,TLR22在5種組織中的表達(dá)均較對(duì)照組顯著上調(diào) (P＜0.05),而注射柱狀黃桿菌 1 d后, TLR22在鰓、脾臟和肝臟組織中的表達(dá)就較對(duì)照組顯著上調(diào) (P＜0.05)。

圖1 柱狀黃桿菌對(duì)草魚TLR3、TLR7、TLR22基因表達(dá)的電泳結(jié)果和相對(duì)表達(dá)量Fig.1 The RT-PCR products and relative expression of TLR3,TLR7,and TLR22 mRNA in grass carp injected with Flavobacterium columnare

3 討論

TLRs是天然免疫在進(jìn)化過程中產(chǎn)生的天然免疫識(shí)別分子,能夠識(shí)別病原相關(guān)分子模式 (pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)[12]。Toll蛋白最早在果蠅體內(nèi)被發(fā)現(xiàn),它是果蠅在胚胎發(fā)育過程中調(diào)節(jié)果蠅背腹部體軸必需的成分蛋白[13]。 20世紀(jì)90年代中期,人們又發(fā)現(xiàn)該蛋白能感受到入侵的病原體,并且在此基礎(chǔ)上使果蠅分泌多種抗微生物感染的多肽清除病原體,Toll受體由此得名[14]?；罨腡LRs能激活T細(xì)胞,啟動(dòng)獲得性免疫反應(yīng)[15]。因此,TLRs在先天性免疫和獲得性免疫兩種機(jī)制中均起著重要作用。

研究表明,TLR3基因是雙鏈RNA病毒模式識(shí)別受體之一,在識(shí)別雙鏈RNA病毒的過程中起著重要作用[16]。Su等[8]在注射草魚出血病病毒(GCRV)1、2、3、4、5、6、7 d后都能檢測(cè)到脾臟中的TLR3基因顯著誘導(dǎo)表達(dá)。在斑馬魚和虹鱒中,病毒也均能誘導(dǎo) TLR3基因的表達(dá)[16-17]。TLR3除了參與抗病毒反應(yīng)外,還能起到抵御細(xì)菌侵襲的作用。Bilodeau等[18]發(fā)現(xiàn),當(dāng)斑點(diǎn)叉尾鮰暴露于有毒力的愛德華氏菌Edwardsiella ictaluri液中時(shí),魚體內(nèi)的TLR3表達(dá)被激活。本研究中發(fā)現(xiàn),用柱狀黃桿菌攻毒草魚7 d后,TLR3在5種組織中的表達(dá)均能顯著被誘導(dǎo)激活。高天珩等[19]發(fā)現(xiàn),黃芪皂甙可以顯著提高TLR3基因在斑點(diǎn)叉尾鮰肝臟中的表達(dá)量,且呈現(xiàn)較為明顯的劑量效應(yīng),這些研究充分表明了TLR3是魚類先天免疫系統(tǒng)中重要的組成部分,不僅在識(shí)別病毒的過程中起著重要作用,而且在抵御病原菌的過程中可被激活。

TLR7作為TLRs家族的一員,在病毒ssRNA的識(shí)別以及感染后的信號(hào)傳導(dǎo)過程中起著重要作用[20]。本研究中發(fā)現(xiàn),草魚在感染柱狀黃桿菌4 d和7 d后,TLR7在鰓、脾臟、肝臟、腸道和頭腎5種組織中的表達(dá)均顯著上調(diào),這與張榮芳[21]的研究結(jié)果比較一致。張榮芳[21]在用草魚呼腸孤病毒感染草魚后,TLR7在草魚鰓、腸、肝臟、脾臟和中腎等組織中的表達(dá)均上調(diào)。這種在細(xì)菌和病毒感染后表達(dá)被激活的現(xiàn)象顯示了TLR7在先天性免疫反應(yīng)中應(yīng)答對(duì)抗細(xì)菌和病毒的免疫效應(yīng)。

TLR22是魚類所特有的TLR識(shí)別受體之一,它是定位于細(xì)胞膜上識(shí)別長(zhǎng)雙鏈RNA的一個(gè)識(shí)別受體,功能和哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上TLR3類似[22-23]。魚類TLR22可以識(shí)別雙鏈RNA和細(xì)菌衍生物,用poly(I∶C)刺激誘導(dǎo)大黃魚后,其頭腎、脾臟組織以及頭腎細(xì)胞中的TLR22基因的表達(dá)也顯著上調(diào)[24]。在注射草魚出血病病毒 (GCRV)2 d后,草魚頭腎和脾臟中TLR22的表達(dá)顯著上調(diào)[25]。熱滅活的殺鮭氣單胞菌以及在培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中活的龜分支桿菌均能顯著上調(diào)TLR22基因的表達(dá)[26]。在體外培養(yǎng)的外周血淋巴細(xì)胞、脾臟和頭腎中,滅活的殺鮭氣單胞菌可誘導(dǎo)TLR22基因表達(dá)上升8倍[27]。本研究中也發(fā)現(xiàn),在用柱狀黃桿菌感染草魚后,5種不同免疫組織中TLR22的表達(dá)均上調(diào),尤其是在感染4 d和7 d后,TLR22相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)。這些研究均表明了TLR22基因在免疫反應(yīng)過程中起著重要作用。

柱狀黃桿菌是引起草魚流行性爛鰓病的一種重要病原,也是引起草魚大規(guī)模死亡的一個(gè)重要病因。在以往的研究中,已知TLR3、TLR7和TLR22在抗病毒的過程中起著非常重要的作用,而從本研究結(jié)果來看,這些TLRs基因在魚類抵御細(xì)菌的過程中同樣也發(fā)揮著積極的作用,TLRs家族及其信號(hào)通路可能參與了機(jī)體對(duì)柱狀黃桿菌的識(shí)別和防御,但具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

致謝:在樣品準(zhǔn)備過程中,中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所魚類免疫學(xué)與寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)了柱狀黃桿菌,同時(shí),李萬雄等同學(xué)在養(yǎng)魚和攻毒試驗(yàn)中提供了幫助,在此一并表示感謝!

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Effects of bacterial pathogen Flavobacterium columnare on expression of Toll receptors genes in grass carp Ctenopharyngodon idella

WEI Li-li,WU Hua-dong,XIONG Liu-feng
(College of Animal Science and Technology,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

In the present study,the expressions of three Toll receptor genes TLR3,TLR7 and TLR22 were investigated in gill,spleen,hepatopancreas,intestine and head kidney in grass carp Ctenopharyngodon idella intraperitoneally injected with bacterial pathogen Flavobacterium columnare G41,4 and 7 days after injection by semi-quantified RT-PCR which were analyzed by electrophoresis on 12 g/L TAE agarose gels.The densitometry was used by Quantity One 4.62,and in the control group,the fish were injected intraperitoneally with sterile phosphate buffer solution(PBS).The results showed that the expression of TLR3 gene was found to be significantly increased in the gill,hepatopancreas,intestine and head kidney 7 days after injection compared with the fish in the control group, and the expressions of TLR7 and TLR22 genes were significantly upregulated in 5 different tissues 4 and 7 days after injection.The expression of TLR22 gene was increased significantly in gill and spleen and hepatopancreas compared with the control fish only 1 day after injection,indicating that TLR3,TLR7 and TLR22 gens are effectively activated after administration by the pathogen F.columnare.

Ctenopharyngodon idella;Flavobacterium columnare;TLRs;gene expression

S185

:A

2095-1388(2013)04-0378-05

2012-12-23

江西省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目 (GJJ11087);江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目 (20114BAB214002)

隗黎麗 (1976-),女,講師,博士。E-mail:hbliliwei@163.com

熊六鳳 (1970-),男,副教授,博士。E-mail:xlf227@126.com