沈永龍,黃金田,戈賢平,王愛民,呂 富,蔡萬存,沈楠楠

(1.鹽城工學院 江蘇省灘涂底棲生物重點實驗室,江蘇 鹽城 224051;2.南京農(nóng)業(yè)大學 無錫漁業(yè)學院,江蘇 無錫 214081)

瘤背石磺(Onchidium struma)是一種棲息于海濱潮間帶的腹足綱貝類,具有極高的營養(yǎng)、藥用和生態(tài)價值[1-2],主要分布于我國江蘇、上海等沿海灘涂地區(qū)。近年來,由于環(huán)境污染和人為濫捕等原因,瘤背石磺資源量急劇下降,甚至已經(jīng)瀕臨滅絕。雖然瘤背石磺的室內(nèi)養(yǎng)殖已獲得初步成功[3],但苗種繁育仍存在“瓶頸”,因此,探索瘤背石磺苗種繁育的關鍵技術迫在眉睫。

目前,國內(nèi)外對石磺研究主要集中于生理形態(tài)[4-5]、生態(tài)習性[6]、生殖繁育[7]以及神經(jīng)生物學[8]等方面,繁育技術方面的研究也相對較多,如沈和定等[9-10]研究了不同溫度和鹽度對石磺胚胎發(fā)育的影響,滕煒鳴等[11]和金春華等[12]分別報道了瘤背石磺灘涂生態(tài)繁殖和人工繁育的關鍵技術,王金慶等[13]研究了石磺胚胎和幼蟲發(fā)育的過程及特點,Ruthensteiner[14]和Smith 等[15]對戴氏石磺(Onchidium damelii)、Deshpande等[16-17]和 Nanaware 等[18]對沃氏石磺(Onchidium verruculatum)的繁殖生物學進行了研究,但迄今為止,對瘤背石磺的繁育尚未形成穩(wěn)定、成熟的技術體系。鑒于此,本試驗旨在進一步探索瘤背石磺受精卵的最佳孵化方式、最適培育密度以及其變態(tài)所需的最適附著基,進而提高瘤背石磺受精卵的孵化率和幼蟲存活率,為深入開展瘤背石磺的人工繁育積累經(jīng)驗。

1 材料和方法

1.1 受精卵的采集和處理

在瘤背石磺自然繁殖季節(jié)選擇來源于鹽城射陽灘涂的規(guī)格均一的瘤背石磺性成熟個體作為親貝,用鹽度 5的海水洗凈后于養(yǎng)殖箱內(nèi)暫養(yǎng)馴化并淘汰品質低劣的個體后,采用鋪設底泥、搭置瓦片等方式模擬生態(tài)環(huán)境進行人工飼養(yǎng)[19],期間飼喂拌有海泥的螺旋藻(m: M/5: 1),并通過噴灑適量鹽度18海水的方式刺激其交配產(chǎn)卵。每日定時檢查養(yǎng)殖箱中瘤背石磺的攝食情況和產(chǎn)卵情況并清潔養(yǎng)殖箱,控制箱內(nèi)溫度(25～28℃)、鹽度(10～15)、相對濕度(80%以上)和光照強度(500 lx左右)。若發(fā)現(xiàn)產(chǎn)有新鮮卵塊,及時用刀片刮取并洗凈后用每升0.12萬國際單位的慶大霉素浸泡 3 min,再將其置于鹽度 18的海水中進行孵化。

1.2 試驗材料及處理

孵化框: 取1 cm×1 cm×20 cm的木條若干,每4只木條用釘子制作成正邊形木框,再將與木框一樣大小的篩絹網(wǎng)(300目)粘到木框的一側并進行編號,注意木框和篩絹網(wǎng)之間不要留下縫隙,以免造成受精卵不必要的流失。使用前用150 mg/L KMnO4消毒1～3 h。

孵化池: 孵化池與親貝養(yǎng)殖箱一樣,均為體積150 L的長方體聚乙烯塑料箱(長×寬×高為70 cm×50 cm×40 cm),使用前與孵化框一樣消毒。

附著基: 準備孔徑為1.0～1.2mm和1.2～1.5mm的海綿條,使用前經(jīng)過煮沸后,再用1～2 mg/L碘海水溶液消毒5～20 min。

藻種培養(yǎng): 選取小球藻(Chlorella vulgaris)、球等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis.Hu.var.sp.)和牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri Lemmerman)等藻種進行擴大培養(yǎng)。開口期投喂小球藻、球等鞭金藻和牟氏角毛藻,餌料密度分別為 22萬、4.5萬和 4.5萬個/mL;當受精卵發(fā)育至 8～15 d時,每天投喂量分別增加至17萬、9萬和9萬個/mL;以后各期投喂量分別增加至13萬、13萬和12萬個/mL。

1.3 試驗設計及日常管理

1.3.1 不同孵化方式對孵化速率的影響

采用3種不同的方式(“噴淋”、“露空”和“梯籠”)進行受精卵的孵化試驗。“噴淋”孵化: 將鋪有受精卵的孵化框置于含有鹽度18海水的孵化池中,同時用水泵抽提海水至水面上方 20 cm處的軟管中,軟管每隔5 cm開有小孔,從小孔噴出水流淋于卵塊表面,模擬自然條件下雨水的作用,刺激卵塊發(fā)育;“露空”孵化: 將受精卵置于底部墊有若干紗布的孵化框上孵化;“梯籠”孵化: 將鋪有受精卵的孵化框一層層疊加,每5個孵化框一組,每組用浸濕的紗布將孵化框包裹好。每天向“露空”孵化組和“梯籠”孵化組噴灑鹽度18的海水,使紗布始終保持濕潤。每天定時觀察各組受精卵的孵化情況,記錄發(fā)育至相應時期所需時間及形態(tài)變化,并及時除去死亡的胚胎。

1.3.2 不同培育密度對存活率的影響

用虹吸法對孵化出膜的幼蟲進行選優(yōu),并將選優(yōu)后的幼蟲分為兩部分,分別移至A孵化池和B孵化池中進行培育。其中A孵化池用于研究培育密度對存活率的影響試驗,B孵化池用于研究附著基對幼蟲附著效果和存活率的影響試驗。攪動A孵化池水體,使幼蟲均勻分布,然后分別在5個不同部位吸取水樣1 mL,對水樣中的幼蟲進行鏡檢計數(shù)。根據(jù)計數(shù)結果從A孵化池量取一定的溶液并轉移至玻璃水族缸中,參照前期探索的結果,用鹽度 18的海水將其稀釋成不同密度梯度,分別為 30、40、50、60、70、80和90個/mL,每個梯度3個重復。每日換水兩次(6:00時和18:00時),每次換水1/2,換水前后水溫變化幅度低于 1℃,鹽度變化幅度低于 2,換水時用300目篩絹網(wǎng)過濾,防止幼蟲的流失。換水后適量添加藻液,同時調節(jié)水體鹽度,使鹽度維持在 18左右。每天 6:00時進行鏡檢,觀察記錄匍匐期幼蟲密度并計算存活率,存活率 = 匍匐幼蟲期密度/初始密度×100%。

1.3.3 不同孔徑海綿附著基對幼蟲附著效果和存活率的影響

從B孵化池中量取適量的溶液,轉移至另外的9個孵化池中,用鹽度18的海水稀釋使其培育密度為50個/mL,將 9個孵化池平均分為 3組,每組 3 個重復,當有15%～20%的幼蟲出現(xiàn)眼點時,在隨機兩組孵化池中分別加入兩種不同孔徑的體積為 1 cm3的立方體海綿。經(jīng)前期大量探索發(fā)現(xiàn)海綿孔徑過低易使其吸水性能差且易浮于水面,因而海綿孔徑分別選取1.0～1.2 mm和1.2～1.5 mm兩種規(guī)格。海綿占孵化池水面的一半,另一組不加海綿。投放海綿后加大換水量,每天換水3次。每天6:00 時進行鏡檢,觀察記錄附著情況并計算存活率,存活率 = 匍匐幼蟲期密度/20%幼蟲出現(xiàn)眼點時密度×100%。

1.3.4 胚胎發(fā)育和幼蟲發(fā)育的觀察以及幼蟲在各水層分布的變化規(guī)律

從受精卵孵化開始至匍匐幼蟲期,連續(xù)取樣觀察胚胎發(fā)育和幼蟲發(fā)育狀況,記錄發(fā)育至相應時期所需時間及形態(tài)變化,并進行生物拍照。同時,測定各水層中幼蟲的數(shù)量,探索不同發(fā)育時期幼蟲在各水層分布的變化規(guī)律,以便更好地了解瘤背石磺幼蟲的總體發(fā)育狀況。具體做法: 待水體靜止后,用膠頭滴管分別吸取孵化池各水層水(表層水、中層水、底層水)1 mL,鏡檢觀察并記錄幼蟲數(shù)量,同一水層隨機選取5個不同方位進行測定。

1.3.5 日常管理

胚胎發(fā)育和幼蟲發(fā)育過程中,通過遮光簾調節(jié)孵化室內(nèi)光照,使之維持在500 lx左右。培育期間所用海水均為鹽度18,溫度25～26 ℃的人工海水,每升水體中添加3 mg EDTA二鈉鹽,以防止重金屬離子在幼蟲體內(nèi)的富集。由于代謝產(chǎn)物長期積累可能影響水質,因此餌料投喂時遵循“少量多次”的原則,并定時對池底進行吸污換水且每5～6 d倒池清底一次,每次換水前仔細檢查篩絹網(wǎng)是否磨損,發(fā)現(xiàn)破損后及時用膠布粘緊,以防幼蟲漏網(wǎng)。另外,每日水體進行連續(xù)微量充氣并攪動水體4～5次,同時測定水體中的溶解氧(≥ 4.5 mg/L)、氨氮(≤ 0.1 mg/L)和pH(8.0～8.4),保證苗種正常培育。當培育后期水質較差時,在孵化池中加入 0.08萬～0.16萬單位硫酸慶大霉素/L,防止水中病原菌的過度繁殖。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步整理后,采用SPSS Statistics V17.0中的單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,并進行 LSD多重比較。統(tǒng)計結果采用平均值±標準誤(Mean ± SE)的形式表示,P＜0.05 認為差異顯著。

2 試驗結果

2.1 不同孵化方式對孵化速率的影響

采用不同的孵化方式對瘤背石磺受精卵(圖 1-1)進行孵化,并連續(xù)觀察受精卵的孵化狀態(tài)。結果表明,孵化方式不同,瘤背石磺受精卵的孵化速率相差很大。采用“露空”孵化方式和“噴淋”孵化方式孵化時,發(fā)育至囊胚期(圖1-2)所需的時間基本一致,均為12 h,但采用“梯籠”孵化方式所需時間較長,為 20 h。當受精卵發(fā)育至出膜面盤幼蟲期(圖1-6)時,采用“露空”孵化方式所需時間最短,僅需6 d,采用“梯籠”孵化方式時所需時間最長,需要9 d。受精卵發(fā)育至原腸期(圖1-3)、“蘑菇幼蟲”期(圖1-4)、膜內(nèi)面盤幼蟲期(圖 1-5)的孵化速率由高到低均依次為“露空”孵化方式、“噴淋”孵化方式和“梯籠”孵化方式(表1)。

2.2 不同培育密度對存活率的影響

由圖2可知,在瘤背石磺幼蟲培育過程中,幼蟲密度對存活率影響顯著(P＜0.05)。隨著孵化池中幼蟲密度的升高,幼蟲的存活率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。用二次多項式回歸模型分析存活率與幼蟲密度之間的關系,得到的回歸方程為: Y = ?0.0679X2+7.8214X ? 147.43 (R2= 0.9351)(圖 2),當 X =57.59時,瘤背石磺的存活率最高,且當55≤X≤61時,瘤背石磺的存活率均大于 80%,因此瘤背石磺在幼蟲培育過程中,培育密度為55～61個/mL時可最大限度提高存活率。

2.3 不同孔徑海綿附著基對幼蟲附著效果和存活率的影響

由圖 3可知,以海綿作為瘤背石磺的附著基時,附著效果良好,且大孔徑(1.2～1.5 mm)海綿的幼蟲附著能力明顯高于小孔徑(1.0～1.2 mm)海綿。由圖4可以看出,大孔徑海綿組的幼蟲存活率較高,為 61.8%,顯著高于小孔徑海綿組的幼蟲存活率(P＜0.05);同時,添加附著基的兩組孵化池中幼蟲的存活率均顯著高于不添加附著基組的存活率(P＜0.05)。

2.4 幼蟲在水層分布的變化規(guī)律

由圖5可知,瘤背石磺受精卵發(fā)育至第5天時,表層水中幼蟲含量大幅升高,直至第 10天時,幼蟲含量顯著下降,而此時底層水的幼蟲含量開始顯著升高,但升高幅度較表層水低,且在第 14天時開始呈下降趨勢。對于中層水中幼蟲的數(shù)量,僅在第5天至第14天時數(shù)量變化較為明顯,但變動幅度仍相對較小,說明瘤背石磺幼蟲一般不在中層水活動。當受精卵發(fā)育至第16天后,表層水和中層水中幾乎觀察不到幼蟲,僅可見于底層水中。

表1 不同孵化方式對受精卵孵化速率的影響Tab.1 Effects of different incubation ways on hatching rate of fertilized eggs of O.struma

圖1 瘤背石磺受精卵的孵化Fig.1 Hatching of fertilized eggs of O.struma

3 討論

3.1 不同孵化方式對孵化速率的影響

瘤背石磺受精卵的孵化速率不僅受孵化期間的溫度、鹽度、濕度以及光照強度等因素影響[20],還與卵群的陰干刺激和新鮮海水刺激密切相關。Smith等[15]報道戴氏石磺從卵裂期至囊胚期發(fā)育所需時間僅為6 h,而瘤背石磺受精卵發(fā)育至相同時期時所需時間比戴氏石磺長兩倍,這可能是因為瘤背石磺與戴氏石磺所處的緯度不同,有一定的溫度差異,從而引起的發(fā)育速率不同。本試驗中“噴淋”孵化雖可模擬自然雨水的沖洗作用,但所需時間較“露空”孵化方式長,其主要原因可能是“露空”孵化方式在孵化過程中溫度相對較高,并伴有一定的陰干刺激,因而發(fā)育速率較快,這說明新鮮海水刺激方式和陰干刺激方式對瘤背石磺受精卵的孵化具有協(xié)同作用。另外,滕煒鳴等[11]對瘤背石磺的灘涂生態(tài)繁殖的研究也表明濕潤泥土上的幼蟲出膜速度要快于水體中,因此可以推斷,陰干刺激對促進瘤背石磺受精卵的孵化作用相對較大。對于“梯籠”孵化方式,其孵化速率從受精卵開始分裂時就顯著低于“露空”孵化和“噴淋”孵化,這可能是因為孵化框疊加后,單位空間內(nèi)受精卵的密度相對較高,從而產(chǎn)生環(huán)境脅迫作用,同時其釋放的代謝產(chǎn)物不斷累積,污染了孵化環(huán)境,從而使受精卵孵化速率明顯降低。

圖2 不同培育密度對存活率的影響Fig.2 Effect of different nurture density on the survival rate of larvae hatched

圖3 不同孔徑海綿附著基附著的幼蟲數(shù)量Fig.3 The amount of larvae attached to different pore size sponge

圖4 不同附著基對存活率的影響Fig.4 Effect of different pore size sponge on the survival rate of larvae hatched

圖5 瘤背石磺幼蟲在水層中的變化規(guī)律Fig.5 The variation of larvae distribution in the water layer

3.2 不同培育密度對存活率的影響

眾所周知,密度因子對幼蟲培育產(chǎn)生的影響主要表現(xiàn)在兩個方面: 一是個體之間直接對空間和食物的競爭;二是影響環(huán)境,環(huán)境因子又反作用于自身[21],從而對幼蟲生長速率、存活率、變態(tài)率和存活率等產(chǎn)生影響。趙越等[22]對四角蛤蜊的研究結果顯示幼蟲的存活率和變態(tài)率隨著培育密度的增大而降低,發(fā)育時間隨著密度的增加而延長,本試驗與此基本一致。周琳等[23]對青蛤的研究表明其培育密度為6～11個/mL時孵化率最高,生長速率最快;閆喜武等[24-25]對長竹蟶和菲律賓蛤仔以及李華林等[26]對長牡蠣等的研究結果顯示,其最適的幼蟲培育密度分別為5～10個/mL、6～10個/mL和6～12個/mL,由此可以看出雙殼類幼蟲培育的最適密度為 6～10個/mL左右。但瘤背石磺幼蟲存活率最高時的培育密度與此相差較大,為57.59個/mL左右,顯著高于其他貝類的幼蟲培育密度,這可能是因為剛出膜的瘤背石磺幼蟲卵黃粒充滿貝殼,其生物量相對較低;同時其幼蟲與方斑東風螺和糙海參等幼蟲相比相對偏小(瘤背石磺自由生活面盤幼蟲平均殼長×殼高為180.2 μm×177.2 μm[7];方斑東風螺剛出膜幼蟲殼長428.7 μm±10.6 μm[27];糙海參初耳幼體體高 350～420 μm[28]),使其耗氧率降低,且在瘤背石磺幼蟲培育過程中,及時換水并清除孵化池中的代謝廢物,消除了環(huán)境脅迫對幼蟲影響,從而使培育密度可以達到較高水平。

3.3 不同孔徑海綿附著基對幼蟲附著效果和存活率的影響

貝類幼蟲經(jīng)過附著變態(tài)后,其外部形態(tài)、內(nèi)部構造、生理機能和生活習性等方面都發(fā)生了相當大的變化。在附著變態(tài)過程中不僅需要消耗大量的能量、適宜的附著基,更重要的是尋找到附著基的時機,一般瘤背石磺眼點出現(xiàn)時,幼蟲出現(xiàn)運動遲緩現(xiàn)象,當有 15%～20%眼點出現(xiàn)時即是附著基投放的最佳時機。影響幼蟲附著變態(tài)的因素很多,主要有生物因子(如幼蟲行為)、物理因子[29-31](溫度、鹽度等)、化學因子[32](如同種個體分泌物)以及微生物膜[33]等。金春華等[12]研究了不同附著基對瘤背石磺幼蟲的附著效果,結果顯示懸浮球和六角蜂窩對瘤背石磺幼蟲的附著效果最好。本試驗采用不同孔徑的海綿作為附著基,發(fā)現(xiàn)大孔徑(1.2～1.5 mm)海綿對瘤背石磺幼蟲的附著效果較好,其最終存活率可達到 61.8%,顯著高于添加小孔徑(1.0～1.2 mm)海綿的孵化池的幼蟲存活率。這說明大孔徑海綿表面更能使瘤背石磺幼蟲產(chǎn)生適應性,或者說瘤背石磺幼蟲對大孔徑海綿的表面結構更具有敏感性,促使其體內(nèi)分泌有關激素,誘導幼蟲完成變態(tài)過程。同時,大孔徑海綿附著的幼蟲多,其分泌的能夠誘導同種幼蟲附著的分泌物也較多,從而產(chǎn)生了“群聚行為”,誘導更多的幼蟲附著變態(tài)。另外,大孔徑海綿所具有的有效表面積較大,吸濕性較好,更利于幼蟲的附著,從這方面看,大孔徑海綿的附著效果較小孔徑海綿的好。

3.4 幼蟲在水層分布的變化規(guī)律

貝類浮游幼蟲在水體中的垂直變化規(guī)律主要與趨光性、餌料分布等因素有關。瘤背石磺同其他腹足綱貝類一致[34],其幼蟲具有階段浮游性,面盤幼蟲期貝殼形成開始,瘤背石磺幼蟲的浮游能力減弱,面盤開始退化,足開始發(fā)育,幼蟲逐漸由浮游生活轉變?yōu)橘橘肷睢⒄吂庑赞D變?yōu)樨撢吂庑?由此形成幼蟲由表層水向底層水轉移的現(xiàn)象。對于中層水中的幼蟲數(shù)量,變動幅度相對較小且無規(guī)律,這可能是由于中層水中幼蟲數(shù)量的變化只是大量幼蟲在表層水中活動的結果,當幼蟲數(shù)量較少時,并不會出現(xiàn)在中水層。因此,瘤背石磺幼蟲在水層中的變化規(guī)律與幼蟲的發(fā)育時期密切相關,掌握瘤背石磺幼蟲的水層分布狀況對瘤背石磺的幼蟲發(fā)育狀況、提高瘤背石磺幼蟲成活率具有重要輔助作用。

4 結論

綜上所述,“露空”孵化方式能顯著縮短瘤背石磺受精卵孵化所需時間,從而驗證了陰干刺激和新鮮海水刺激對瘤背石磺受精卵的孵化具有協(xié)同作用。其次,瘤背石磺幼蟲期的最適培育密度與其他貝類相比差別較大,為55～61個/mL。同時,在幼蟲附著變態(tài)時期,幼蟲對大孔徑海綿附著基敏感性較強,附著效果較好,存活率較高。另外,瘤背石磺幼蟲在水層中的分布變化與幼蟲的發(fā)育時期具有一致性,觀察幼蟲的水層分布情況能夠更準確的預測幼蟲發(fā)育狀況。

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