丁淑云，康紹叁，景中民，鄭振武，張秀平，高偉興

(1河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院曹妃甸區(qū)醫(yī)院，河北唐山063000;2河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院;3駐馬店市中心人民醫(yī)院)

聯(lián)合多烯紫杉醇治療雄激素非依賴性前列腺癌(AIPC)的有效性已得到臨床研究證實(shí)，但發(fā)現(xiàn)其延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間極為有限［1，2］。酪氨酸激酶(JAK)抑制劑AG490是一種人工合成的苯亞甲基丙二睛的脂類衍生物，通過阻斷JAK/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)信號(hào)通路，能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡。2010年12月～2013年1月，我們觀察了多烯紫杉醇聯(lián)合AG490對(duì)前列腺癌DU-145細(xì)胞增殖凋亡的影響，旨在探討二者聯(lián)合應(yīng)用治療晚期前列腺癌的可行性及機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料 人前列腺癌細(xì)胞株DU-145購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。多烯紫杉醇為Sigma公司產(chǎn)品，AG490為Merck公司產(chǎn)品，胎牛血清、胰蛋白酶及F12培養(yǎng)基均為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，噻唑藍(lán)(MTT)購自天津?yàn)笊镉邢薰?。Annexin-V凋亡試劑盒為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。Bcl-2兔抗人多克隆抗體和DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物制品有限公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng) 將 DU-145細(xì)胞(培養(yǎng)于含有90%F12的培養(yǎng)液中)置于含10%胎牛血清，青、鏈霉素各100 U/mL的培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，每24 h更換培養(yǎng)液1次。細(xì)胞90%匯合時(shí)用0．25%胰蛋白酶消化傳代，每周2、3次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．2．2 細(xì)胞干預(yù)及細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率檢測(cè) 將DU-145細(xì)胞以1×105/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板中，150μL/孔，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后分為三組。紫杉醇組分別加入10、100、1 000 nmol/L的多烯紫杉醇;AG490組分別加入 10、20、40、80 μmol/L的AG490;聯(lián)合組分為聯(lián)合1、2、3組，分別加入10、100、1 000 nmol/L的多烯紫杉醇及40μmol/L的AG490，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。對(duì)照組不做特殊處理，每天更換F12培養(yǎng)基。終止前4 h每孔加入MTT溶液20μL(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)，終止時(shí)吸盡培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 50μL水平搖床上振蕩10 min，于酶標(biāo)儀上(波長(zhǎng)490 nm)測(cè)定各孔吸光度值(OD值)。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=1-(藥物組平均OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1．2．3 細(xì)胞干預(yù)及細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 將DU-145細(xì)胞懸液(1×106個(gè))接種于6孔培養(yǎng)板中，紫杉醇組加入濃度為100 nmol/L的多烯紫杉醇;AG490組加入濃度為40μmol/L的AG490;聯(lián)合組加入上述兩種藥物(濃度同上)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h;對(duì)照組不做特殊處理，每天更換F12培養(yǎng)基。收集貼壁及懸浮細(xì)胞，1 000 r/min，離心5 min，棄上清液。加入PBS(pH=7．4)2 mL洗滌，1 000 r/min，離心5 min。棄上清液，將細(xì)胞重懸于200μL Binding Buffer;加入10μL Annexin V-FITC和5μL PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，加入300μL Binding Buffer，l h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1．2．4 細(xì)胞干預(yù)及Bcl-2表達(dá)檢測(cè) 將DU-145細(xì)胞以1×104/mL接種于6孔培養(yǎng)板中，150μL/孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，細(xì)胞分組及干預(yù)同1．2．3。干預(yù)后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，傾去培養(yǎng)液，每孔PBS洗2次，3 min/次，每孔加4%多聚甲醛2 mL，固定細(xì)胞30 min，PBS洗2 min×3次，制成細(xì)胞爬片。按照免疫組化染色試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，以PBS替代第一抗體作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定:Bcl-2陽性染色為細(xì)胞質(zhì)棕黃色顆粒。排除爬片邊緣細(xì)胞，隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，計(jì)算高倍視野細(xì)胞中Bcl-2蛋白陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，取平均值作標(biāo)記指數(shù)(PI)，PI=(視野中陽性細(xì)胞數(shù))/(視野中陽性細(xì)胞數(shù)+視野中陰性細(xì)胞數(shù))×100%。

1．2．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和方差分析。以P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 不同濃度多烯紫杉醇干預(yù)對(duì)DU-145細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響見表1，不同濃度AG490干預(yù)對(duì)DU-145細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響見表2，多烯紫杉醇及AG490聯(lián)合干預(yù)對(duì)DU-145細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響見表3。分析表1～表3結(jié)果，紫杉醇、AG490及二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)DU-145細(xì)胞增殖均有明顯抑制作用，且呈時(shí)間和劑量依賴性。各干預(yù)組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與對(duì)照組(0 nmol/L)比較，P均＜0．05;聯(lián)合組分別與紫杉醇組及AG490組比較，P均 ＜0．05。

2．2 細(xì)胞凋亡率 干預(yù)48 h后對(duì)照組、紫杉醇組、AG490組及聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率分別為(7．25±1．08)%、(27．14 ± 3．27)%、(21．29 ± 3．89)%、(57．45±5．06)%。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，P均＜0．05，聯(lián)合組分別與紫杉醇組、AG490組比較，P均

表1 不同濃度多烯紫杉醇干預(yù)對(duì)DU-145細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響(%，ˉx ± s)

表2 不同濃度AG490對(duì)DU-145細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響(%，ˉx ±s)

表3 多烯紫杉醇與AG490聯(lián)合應(yīng)用對(duì)DU-145細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響(%，ˉx±s)

2．3 細(xì)胞 Bcl-2蛋白表達(dá) 對(duì)照組、紫杉醇組、AG490組及聯(lián)合組 Bcl-2蛋白陽性表達(dá)率分別(70．45 ± 5．24)%、(40．15 ± 7．36)%、(31．78 ±6．79)%、(10．05 ±1．24)%，各干預(yù)組與對(duì)照組比較，P均 ＜0．05，其中聯(lián)合組分別與紫杉醇組、AG490組比較，P均 ＜0．05;紫杉醇組與 AG490組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

多烯紫杉醇是一種半合成的紫杉醇類衍生物，研究發(fā)現(xiàn)，其可通過促進(jìn)細(xì)胞微管聚合，阻止微管正常的生理解聚，將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，影響細(xì)胞有絲分裂過程，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡［3，4］。有報(bào)道，多烯紫杉醇聯(lián)合潑尼松可延長(zhǎng)AIPC患者生命，降低死亡風(fēng)險(xiǎn)，療效及耐受性優(yōu)于多烯紫杉醇與其他藥物聯(lián)合，目前是AIPC患者的一線標(biāo)準(zhǔn)治療方案［1］。但其臨床療效并不盡如人意，患者中位生存時(shí)間僅為18．9個(gè)月，死亡風(fēng)險(xiǎn)僅降低24%。因此，探討晚期前列腺癌發(fā)生激素抵抗的機(jī)制和尋找合適的聯(lián)合藥物是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。

JAK/STAT信號(hào)通路是與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化關(guān)系十分密切的一條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其基本作用模式為:配體與受體結(jié)合導(dǎo)致受體二聚化;激活JAK;JAK將STAT磷酸化;STAT形成二聚體，暴露出入核信號(hào);STAT進(jìn)入核內(nèi)，調(diào)節(jié)基因表達(dá)［5］。Lee等［6］研究發(fā)現(xiàn)，JAK/STAT通路異常激活與包括前列腺癌在內(nèi)的諸多腫瘤細(xì)胞增殖、分化及凋亡密切相關(guān)。AG490是一種人工合成的苯亞甲基丙二睛的脂類衍生物，結(jié)構(gòu)類似于酪氨酸，可與受體酪氨酸激酶競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位置，特異性阻滯各種細(xì)胞因子引起的JAK2和下游分子STAT3的磷酸化激活，從而阻斷JAK/STAT信號(hào)通路。劉青娟等［7］實(shí)驗(yàn)證實(shí)，高糖通過激活小鼠足細(xì)胞中JAK/STAT信號(hào)通路，誘導(dǎo)足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，采用AG490進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞中 α-SMA蛋白及其 mRNA表達(dá)明顯降低。AG490作為抗腫瘤藥物已用于臨床治療白血病，特別是對(duì)JAK2異常活化導(dǎo)致的前B急性淋巴細(xì)胞白血病具有很好的治療作用，且毒副作用很?。?］，但其應(yīng)用于治療前列腺癌的報(bào)道較少。

本研究結(jié)果顯示，多烯紫杉醇和AG490在作用于DU-145細(xì)胞24 h和48 h后，隨著各自藥物濃度的增加，細(xì)胞增殖受到顯著抑制，且呈時(shí)間和劑量依賴性。兩者聯(lián)合作用于DU-145細(xì)胞24 h和48 h后，隨著多烯紫杉醇濃度的增加，細(xì)胞抑制率增加，也呈時(shí)間和劑量依賴性;多烯紫杉醇聯(lián)合AG490在作用于DU-145細(xì)胞48 h后，可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率高于紫杉醇組及AG490組。上述結(jié)果說明多烯紫杉醇和AG490均可抑制DU-145細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡;二者聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同作用。

Bcl-2作為抑制凋亡基因家族中一個(gè)重要成員，被稱為細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)因子，其通過抑制細(xì)胞的程序性死亡過程而延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命，使細(xì)胞的數(shù)量增多，基因變異的可能性增加，進(jìn)而有助于腫瘤的發(fā)生發(fā)展［9］。Dingemans等［10］的研究顯示，多烯紫杉醇能誘導(dǎo)Bcl-2蛋白的磷酸化，導(dǎo)致Bcl-2/bax異二聚體減少，Bcl-2/bax二聚體增加，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。Buettner等［11］研究還發(fā)現(xiàn)，STAT的持續(xù)激活可以調(diào)控Bcl-2基因，導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和惡變，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。因此，阻斷該通路成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，各干預(yù)組干預(yù)后Bcl-2蛋白陽性表達(dá)率顯著降低，其中聯(lián)合組Bcl-2蛋白陽性表達(dá)率變化明顯低于紫杉醇組及AG490組，與上述研究結(jié)果一致。說明多烯紫杉醇和AG490誘導(dǎo)DU-145細(xì)胞凋亡均可通過Bcl-2介導(dǎo)。

綜上所述，多烯紫杉醇和AG490均可抑制DU-145細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。二者抗癌機(jī)制不同，聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同作用，可提高化療療效、降低化療藥物濃度，減輕化療副作用，防止或延緩腫瘤耐藥性的產(chǎn)生。但對(duì)于AG490用于AIPC治療的毒副反應(yīng)，二者最佳濃度搭配及用藥先后順序等問題還有待于進(jìn)一步研究。

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