翟永貞 馬 力 馮國(guó)和 (中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院感染科，沈陽(yáng) 110004)

日本腦炎(Japanese encephalitis，JE)DNA疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫和體液免疫仍達(dá)不到預(yù)期效果，一系列措施用來(lái)增強(qiáng)JE DNA疫苗的免疫效果［1］。目前越來(lái)越多的研究表明，樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)是DNA疫苗免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)，質(zhì)粒DNA可直接轉(zhuǎn)染注射部位抗原提呈細(xì)胞，質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)染抗原提呈細(xì)胞是誘導(dǎo)特異性CTL應(yīng)答最有效的途徑［2］。因此，如何通過(guò)各種途徑促進(jìn)DCs的成熟、增強(qiáng)DCs的功能，最終誘導(dǎo)DNA疫苗產(chǎn)生廣泛的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，是優(yōu)化DNA疫苗的一種關(guān)鍵策略。

DCs刺激抗原特異的T細(xì)胞啟動(dòng)依賴(lài)于DCs向T細(xì)胞傳遞的兩個(gè)信號(hào)，除研究最深入的CD28/B7外，細(xì)胞間粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)與淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(Lymphocyte functional antigen-1，LFA-1)也是一對(duì)與 T細(xì)胞活化密切相關(guān)的協(xié)同刺激受體/配體［3］。ICAM-1在基因疫苗方面已有研究報(bào)道，有學(xué)者研究表明ICAM-1能提供給T細(xì)胞共刺激信號(hào)，并且證實(shí)該刺激信號(hào)通路獨(dú)立于CD86介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的第二信號(hào)通路［4］。

基于上述研究結(jié)果，本研究采用肌注方式對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行DNA疫苗免疫，聯(lián)合ICAM-1編碼基因進(jìn)一步促進(jìn)APC與T細(xì)胞接觸區(qū)域的相互作用，從免疫鼠脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞吞噬能力、表面分子表達(dá)、刺激T淋巴細(xì)胞增殖多層面觀察ICAM-1編碼基因?qū)ζ⑴K樹(shù)突狀細(xì)胞功能的影響，明確ICAM-1編碼基因在小鼠脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞與T細(xì)胞相互作用中的意義，為JE DNA疫苗增強(qiáng)效應(yīng)的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 質(zhì)粒、細(xì)胞及主要試劑 含JEV prME蛋白編碼基因重組質(zhì)粒被命名為pJME，由感染科實(shí)驗(yàn)室保存。真核表達(dá)載體pcDNA3．1(+)購(gòu)自Invitrogen公司。CHO細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)研究院上海細(xì)胞庫(kù)。山羊抗鼠ICAM-1購(gòu)自Santa公司。電致化學(xué)發(fā)光(Electrogenerated chemiluminescence，ECL)檢測(cè)試劑購(gòu)自Pierce公司。熒光標(biāo)記的抗體(CD4-APC，CD8-PE，CD54-PE，CD11c-APC，MHCⅡ-FITC，CD80-PE，CD86-FITC)均購(gòu)自美國(guó) BD PharMingen公司。熒光染料羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的葡聚糖(FITC-Dextran)均購(gòu)自美國(guó)Molecular Probes公司。Mouse T Cell Lympholyte-Pure購(gòu)自加拿大Cedarlane公司。1．2 BALB/c鼠 ICAM-1編碼基因的獲取 從BALB/c鼠肺臟獲取細(xì)胞總RNA，采用套式RT-PCR法擴(kuò)增ICAM-1 CDS區(qū)域序列(1 614 bp)。反轉(zhuǎn)錄引物:5'TGGCTGAGGGTAAATGCTGT3';PCR外引物:上游引物為5'CCCTGCAATGGCTTCAACCC3'，下游引物為上述反轉(zhuǎn)錄引物;PCR內(nèi)引物:上游引物為5'GAATTCGGTGGAGGCGGTTCAGGTGGAGGTGGTTCAGGAGGAGGTGGATCGATGGCTTCAACCCGTGCCAAG3'，下游引物為5'GCGGCCGCTCAGGGAG GTGGGGCTTGT3'，用于PCR內(nèi)引物的上游引物和下游引物的5'端分別引入EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)，劃線(xiàn)部分為由15個(gè)氨基酸組成的Gly-Linker。1%瓊脂糖凝膠電泳并回收最終PCR產(chǎn)物，后者與pMD19-T simple連接構(gòu)建重組子 pMD-ICAM-1，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌JM109，篩選陽(yáng)性克隆并送至大連寶生物工程公司測(cè)序鑒定。

1．3 p ICAM-1、pJME/ICAM-1構(gòu)建和轉(zhuǎn)染分析 將上述測(cè)序正確的目的基因亞克隆至pcDNA3．1(+)，形成重組子pICAM-1。pJME經(jīng)Bam H I和EcoR I雙酶切并亞克隆至 pICAM-1，形成重組子 pJME/ICAM-1。脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染pICAM-1、pJME/ICAM-1于 CHO 細(xì)胞［1］，G418(800 mg/L)篩選質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞抗性克隆株。參照參考文獻(xiàn)［1］并加以改進(jìn)，收集pICAM-1、pJME/ICAM-1轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液破碎細(xì)胞后收集總蛋白，12%和8%SDS-PAGE凝膠電泳完畢后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1小時(shí)，加入山羊抗鼠ICAM-1多克隆抗體(1∶200稀釋)，4℃過(guò)夜，TBST洗滌10分鐘×3次，加入HRP標(biāo)記的兔抗山羊的二抗(1∶50 000稀釋)，室溫2小時(shí)，TBST洗滌10分鐘×3次，加入ECL試劑，顯影、定影。

1．4 動(dòng)物免疫 每組4只BALB/c鼠(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)共5組。實(shí)驗(yàn)組包括pJME、pJME/ICAM-1、pJME+pICAM-1、pcDNA3．1(+)(陰性對(duì)照)以及腹腔注射JE滅活疫苗組(陽(yáng)性對(duì)照)。分別將溶于100μl滅菌PBS的不同免疫原鼠后肢肌內(nèi)注射，每次接種劑量均為100μg，JE滅活疫苗(購(gòu)自北京天壇生物制品公司)100μl/次(相當(dāng)于1/5成人劑量)。間隔兩周加強(qiáng)免疫，共免疫3次，最后1次免疫后21天取小鼠脾臟細(xì)胞檢測(cè)樹(shù)突狀細(xì)胞功能變化。

1．5 小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞的分離 脫頸法處死小鼠，無(wú)菌打開(kāi)腹腔，取出脾臟放入冷PBS中，將其捻碎并濾過(guò)200目無(wú)菌鋼網(wǎng)，收集脾細(xì)胞懸液，參照小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)制備脾臟T淋巴細(xì)胞;另取部分上述脾細(xì)胞懸液，1 300 r/min洗滌5分鐘×3次;用完全培養(yǎng)基20 ml重懸細(xì)胞于250 m l培養(yǎng)瓶(Falcon公司)中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2小時(shí);用完全培養(yǎng)基20 ml劇烈洗搖培養(yǎng)瓶，并吸棄懸液，共4次;加入完全培養(yǎng)基20 ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過(guò)夜;收集懸浮細(xì)胞。

1．6 脾臟DC表面分子檢測(cè) 各組鼠脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞懸液的制備方法同上，1 000 r/min離心10分鐘，PBS重懸細(xì)胞后制成細(xì)胞濃度為1×106m l－1，各免疫組分別取1 m l上述懸液加入到兩個(gè)流式細(xì)胞儀測(cè)定管，用直接免疫熒光標(biāo)記法標(biāo)記DC，細(xì)胞分別與 anti-CD11c-APC、MHCⅡ-FITC、CD54-PE各 1 μg;anti-CD11c-APC、CD80-PE，CD86-FITC 各 1 μg 4℃共同孵育30分鐘，PBS洗滌并重懸，最后以0．5 m l PBS重懸細(xì)胞，4℃保存，于FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD公司)上檢測(cè)，結(jié)果用CellQuest軟件分析。每個(gè)樣品都用熒光標(biāo)記同型IgG作為相應(yīng)的陰性對(duì)照。

1．7 脾臟DC內(nèi)吞能力的檢測(cè) 樹(shù)突狀細(xì)胞懸液的制備方法同上，以FITC-Dextran攝取量的多少來(lái)反映DC的攝取抗原能力。收集各組DC，用10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106cells/m l，分別取1 ml加入1 mg/ml FITC-Dextran，混勻后置37℃孵育1小時(shí)，用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞2次后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以平均熒光密度(mean fluorescence intensity，MFI)表示攝取量。同時(shí)設(shè)4℃對(duì)照并減去其熒光密度來(lái)排除非主動(dòng)性攝取。

1．8 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR) 刺激DC的預(yù)處理:分別收集各組新鮮制備的DC，加入終濃度為25 mg/L的絲裂霉素C，37℃避光水浴30分鐘，PBS洗3次，加入RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸備用。

淋巴細(xì)胞的CFSE標(biāo)記:淋巴細(xì)胞用PBS洗2次，加入2．5μmol/L CFSE染液重懸細(xì)胞并調(diào)細(xì)胞密度至1×107cells/ml，置于37℃水浴15分鐘，每5分鐘振搖1次，RPMI1640完全培養(yǎng)基終止染色，離心后重懸細(xì)胞。

混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng):將DC和淋巴細(xì)胞按1∶10混合，以200μl/孔接種至U形底96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，設(shè)只有淋巴細(xì)胞的孔為對(duì)照。于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)96小時(shí)，收集細(xì)胞并洗滌后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。在前散射(FSC)和對(duì)側(cè)散射(SSC)二維散點(diǎn)圖中劃出淋巴細(xì)胞區(qū)，檢測(cè)FL1熒光強(qiáng)度，獲得的數(shù)據(jù)用CellQuest軟件分析。

1．9 脾CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 流式細(xì)胞儀直接免疫熒光法測(cè)定免疫后BALB/c鼠CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群變化。方法見(jiàn)文獻(xiàn)［1］。

1．10 CTL殺傷活性的測(cè)定 采用LDH釋放實(shí)驗(yàn)試劑盒檢測(cè)CTL活性，方法見(jiàn)文獻(xiàn)［1］。

2 結(jié)果

2．1 pICAM-1、pJME/ICAM-1的重組構(gòu)建 ICAM-1基因和prME/ICAM-1融合基因片段分別被定向克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3．1(+)，得到pICAM-1和pJME/ICAM-1(圖1)。套式RT-PCR法獲得的ICAM-1基因測(cè)序分析與發(fā)表的ICAM-1 CDS區(qū)域序列相符合，經(jīng)酶切鑒定證實(shí)插入片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。質(zhì)粒pICAM-1和pJME/ICAM-1酶切分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 質(zhì)粒pJME/ICAM-1的構(gòu)建過(guò)程Fig．1 The construction of pJME/ICAM-1

表1 不同免疫原對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞表面分子表達(dá)的影響(n=4， ± s，%)Tab．1 Effect of different immunogen on the expression of the dendritic cell surfacemolecules(n=4， ± s，%)

表1 不同免疫原對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞表面分子表達(dá)的影響(n=4， ± s，%)Tab．1 Effect of different immunogen on the expression of the dendritic cell surfacemolecules(n=4， ± s，%)

Note:Compared with the pJME/ICAM-1 group，1)P ＞0．05，2)P ＜0．05;compared with the pJME group，3)P ＜0.05，4)P ＞0．05;compared with the pJME+p ICAM-1 group，5)P ＜0．05;compared with the control group，6)P ＜0．05．

Groups CD11cCD80 CD11cCD86 CD11cICAM-1 CD11cMHC ⅡpJME/ICAM-1 8．75 ±0．10 6．92 ±0．103) 7．18 ±0．10 16．63 ±0．104)6)11．36 ±0．10 pJME+p ICAM-1 7．70 ±0．031) 5．46 ±0．103) 6．21 ±0．102) 15．03 ±0．104)6)pJME 7．15 ±0．032) 3．46 ±0．10 3．95 ±0．102)5) 14．64 ±0．16)JE inactivated vaccine 6．79 ±0．032) 3．57 ±0．104) 3．53 ±0．102)4)5) 11．44 ±0．10 pcDNA3．1(+) 6．81 ±0．022) 2．00 ±0．103) 2．61 ±0．102)

圖2 質(zhì)粒p ICAM-1，pJME/ICAM-1的酶切分析Fig．2 Restriction endonuclease analysis of p ICAM-1 and p JME/ICAM-1

2．2 pICAM-1、pJME/ICAM-1 轉(zhuǎn)染的 CHO 細(xì)胞 Western blot分析 將p ICAM-1、pJME/ICAM-1轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞裂解并收集蛋白進(jìn)行 Western blot分析，分別在Mr為60×103和130×103區(qū)域處可見(jiàn)一特異性蛋白帶，空載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞未見(jiàn)相應(yīng)蛋白帶(圖3)。

2．3 DC表面分子表達(dá) DC表面標(biāo)志的結(jié)果見(jiàn)表1。各組DC表面表達(dá)高水平MHCⅡ，pJME/ICAM-1組、pJME+p ICAM-1組、pJME組高于JE滅活疫苗組及空載體免疫組(P＜0．05)，三組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05);pJME/ICAM-1組 CD11c+CD80+DC比例為(8．75±2．32)%，高于 pJME組、JE滅活疫苗組及空載體免疫組(均 P＜0．05)，pJME+p ICAM-1組CD11c+CD80+DC比例為(7.70±0.70)%，與 pJME/ICAM-1組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05);pJME組與JE滅活疫苗組DC表面CD86比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，其余各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均 P＜0.05);pJME/ICAM-1組、pJME+p ICAM-1組DC表面表達(dá)高水平ICAM-1，CD11c+ICAM-1+DC比例分別為(7．18 ±0．57)%、(6．01 ±0．82)%、高于 pJME組、JE滅活疫苗組及空載體免疫組(均P＜0．05)，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。

圖3 重組蛋白ICAM-1和prME/ICAM-1的W estern b lot分析Fig．3 W estern blot identification of recombinant protein ICAM-1 and prME/ICAM-1

圖4 不同免疫組脾臟DC攝取抗原能力(n=4，±s)Fig．4 The capacity of antigen uptake from the splenic DCs among the different vaccinated groups(n=4，±s)

圖5 不同免疫組混合淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(n=4，±s)Fig．5 M ixed lym phocyte reaction in the different vaccinated groups(n=4，±s)

2．4 DC的內(nèi)吞能力 DC可通過(guò)其表面甘露糖受體主動(dòng)吞噬Dextran。熒光標(biāo)記的Dextran被DC吞噬后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC的平均熒光密度(MFI)可反映其內(nèi)吞能力和攝取抗原的能力。圖4結(jié)果顯示，pJME/ICAM-1組與pJME+pICAM-1組內(nèi)吞能力較強(qiáng)，平均熒光強(qiáng)度分別為437．11±47.60、416．67 ± 29．12，顯著高于其它各組(P ＜0.05)。pJME/ICAM-1組與 pJME+pICAM-1組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。

2．5 DC誘導(dǎo)的MLR 比較不同免疫原對(duì)細(xì)胞分裂的作用，以 pJME/ICAM-1組最強(qiáng)，(73．69±7.32)%CD4+T 細(xì)胞發(fā)生分裂，(45．40 ±2．57)%CD8+T細(xì)胞發(fā)生分裂，顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);pJME+pICAM-1 組次之，(53．48 ±5．23)%CD4+T細(xì)胞發(fā)生分裂，(35．85±4．46)%CD8+T 細(xì)胞發(fā)生分裂，顯著高于pJME組、JE滅活疫苗組及空載體免疫組(均 P ＜0．05)，見(jiàn)圖5。

圖6 3次免疫后小鼠脾臟CD3+CD4+/CD3+CD8+T細(xì)胞亞群分析(n=4，±s)Fig．6 Analysis of CD3+CD4+/CD3+CD8+T lym phocyte subsets from sp leen of mice after three times immunizations(n=4，±s)

圖7 3次免疫后小鼠脾T細(xì)胞特異性CTL的活性(n=4， ±s，E∶T=10∶1)Fig．7 Specific lysis of sp lenic T lym phocyte from BALB/c mice after three times immunizations(n=4，±s，E∶T=10∶1)

2．6 脾CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群分析pJME/ICAM-1組CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞比例為(36.1±6．45)%，明顯高于其它組(P ＜0．05);pcDNA3.1(+)組CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞比例為(20．87±4.45)%，低于其它組(P ＜0．05);pJME+pICAM-1組CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞比例為(31．23±6．55)%，高于pJME組(25．26±9．72)%及 JE 滅活疫苗組(25.35±3.82)%(P＜0．05)。各免疫組間CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例無(wú)顯著性差異(均P＞0．05)，見(jiàn)圖6。

2．7 CTL殺傷活性的測(cè)定 LDH釋放法檢測(cè)免疫小鼠脾細(xì)胞抗原特異性的CTL活性，效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞為10∶1時(shí)，各組免疫鼠CTL活性由高至低依次為:pJME/ICAM-1 組(56．38 ±5．69)%、pJME+p ICAM-1組(50．37 ±6．33)%、pJME 組(35．25 ±4.78)%、JE 滅活疫苗組(26．72±3．78)%、pcDNA3．1(+)組(12．34 ±7．73)%，各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0．05)，見(jiàn)圖7。

3 討論

研究表明，將目的抗原基因與樹(shù)突狀細(xì)胞/T細(xì)胞表面特異性受體編碼基因共價(jià)連接于同一表達(dá)載體能夠使表達(dá)的融合蛋白靶向結(jié)合于抗原提呈細(xì)胞或T細(xì)胞表面相應(yīng)配體，進(jìn)而改善抗原的攝取與遞呈，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答［5，6］?；?ICAM-1 的生物活性，本項(xiàng)研究探究ICAM-1兩種構(gòu)建方式對(duì)JE DNA疫苗樹(shù)突狀細(xì)胞功能的影響，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于pJME+pICAM-1免疫組，pJME/ICAM-1免疫組DC表面高表達(dá)ICAM-1和CD86，而MHCⅡ和CD80表達(dá)水平無(wú)明顯升高，能夠明顯刺激BALB/c鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖，提示在本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袑EVprME蛋白與ICAM-1編碼基因融合構(gòu)建于同一真核表達(dá)載體主要上調(diào)DC表面ICAM-1和CD86表達(dá)，究其原因可能因?yàn)镮CAM-1編碼基因融合構(gòu)建更有利于加強(qiáng)APC的轉(zhuǎn)染，放大B7分子提供到T細(xì)胞上的協(xié)同刺激信號(hào)。

DC活化是T細(xì)胞激活和產(chǎn)生抗原特異性免疫反應(yīng)的先決條件。細(xì)胞表型和抗原攝取、加工、遞呈功能之間的相互關(guān)系已經(jīng)被認(rèn)為是評(píng)估DC成熟狀態(tài)的方式［7］。非成熟的DC有較高的抗原吞噬功能，低水平表達(dá)共刺激分子和MHCⅡ，T細(xì)胞的刺激能力較弱。成熟的DC有較低的抗原吞噬功能，高水平表達(dá)共刺激分子和MHCⅡ，刺激T細(xì)胞能力較強(qiáng)。本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，與pJME、JE滅活疫苗以及空載體免疫組比較，ICAM-1編碼基因能夠顯著增加DC表面CD80、CD86、ICAM-1的表達(dá)水平，增強(qiáng)DC的抗原吞噬能力和對(duì)脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖能力，提示ICAM-1編碼基因能夠促進(jìn)JE DNA疫苗脾臟DC的成熟，通過(guò)上調(diào) DC表面 ICAM-1、B7．1(CD80)和B7．2(CD86)輔助刺激分子，促進(jìn)DCs與T細(xì)胞的相互作用，使DCs能有效地誘導(dǎo)T細(xì)胞活化。然而本研究中 pJME/ICAM-1或 pJME+p ICAM-1產(chǎn)生的DC沒(méi)有顯示出所有的成熟或非成熟 DC 應(yīng)有的特征，同 Daro［8，9］報(bào)道的一樣，這種現(xiàn)象的出現(xiàn)可能與DC亞群的多態(tài)性、DC成熟的過(guò)程中其表型和功能不同步過(guò)渡、ICAM-1可以直接或者間接的調(diào)節(jié)DC表型和/或其功能等有關(guān)，確切的機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

ICAM-1作為協(xié)同刺激分子能夠增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)［10］，對(duì)于CD8+T細(xì)胞活化和發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng)功能是必需的［11］。本研究發(fā)現(xiàn)CD3+CD8+T細(xì)胞比例與CTL活性缺乏一致性，各免疫組CD3+CD8+T細(xì)胞比例無(wú)顯著性差異(均P＞0．05)，但不同免疫組所致JEV特異性CTL殺傷活性各不相同，pJME/ICAM-1免疫組所致JEV特異性CTL殺傷活性明顯高于其他免疫組(P＜0．05)，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均 P＜0．05)，ICAM-1編碼基因能夠明顯增強(qiáng)JEV特異性CTL殺傷活性，已有研究表明ICAM-1/LFA-1相互作用對(duì)初始CD4+T細(xì)胞的活化非常重要［12］，CD4+T細(xì)胞在增強(qiáng)CTL殺傷活性方面起著關(guān)鍵作用［13，14］。我們的研究也發(fā)現(xiàn)pJME/ICAM-1組獲得了最高的CD3+CD4+T細(xì)胞比例，pJME+pICAM-1組次之，兩者均誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，與其所獲得的JEV特異性CTL殺傷活性有相關(guān)性。

比較ICAM-1編碼基因兩種構(gòu)建方式免疫效果發(fā)現(xiàn)，pJME/ICAM-1免疫組能夠進(jìn)一步擴(kuò)大上述免疫效應(yīng)，能夠顯著促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)產(chǎn)生最強(qiáng)的JEV特異性CTL殺傷活性，可能與融合蛋白編碼基因重組子延長(zhǎng)ICAM-1半衰期、有效活化T細(xì)胞與APC或靶細(xì)胞間免疫突觸有關(guān)。

綜上所述，本項(xiàng)研究提示ICAM-1編碼基因有可能通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠脾臟DC的功能決定細(xì)胞免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和類(lèi)型，確切的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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