李冬梅 汪 偉 黃可欣 馬洪喜 (長春大學(xué)特殊教育學(xué)院，長春 130022)

目前已證實(shí)植物性食品中含有一定濃度的稀土元素，隨著稀土微肥的廣泛應(yīng)用，稀土元素可經(jīng)食物鏈進(jìn)入機(jī)體內(nèi)［1］。近年來有些學(xué)者報道了較低劑量的稀土化合物經(jīng)口服、腹腔注射及尾靜脈注射可使血清中生長激素及胰島素水平顯著升高［2，3］。糖尿病心肌病是一種獨(dú)立的糖尿病心血管并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，至今仍未完全闡明。目前研究認(rèn)為糖尿病時高血糖可通過多種途徑激活機(jī)體炎癥反應(yīng)，是導(dǎo)致糖尿病繼發(fā)性病變的重要原因。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，它參與轉(zhuǎn)錄和表達(dá)眾多與免疫和炎癥反應(yīng)有關(guān)的炎癥性細(xì)胞因子［4］。本實(shí)驗(yàn)通過建立糖尿病大鼠模型，觀察到口服硝酸鑭(0．2 mg/kg)可抑制糖尿病大鼠 NF-κB、TNF-α的表達(dá)對糖尿病大鼠心肌組織有一定的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑 健康雄性Wistar大鼠45只，體重為190～210 g，由吉林省藥品檢驗(yàn)所提供(動物合格證號960101032);硝酸鑭由全國農(nóng)用稀土研究中心提供;實(shí)驗(yàn)用“硝酸鑭”用生理鹽水稀釋成相應(yīng)濃度;鏈脲佐菌素(STZ)購于美國Sigma公司。

1．2 糖尿病模型制備 在實(shí)驗(yàn)分組前，首先制備糖尿病模型，隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)動物35只，腹腔注射STZ(用新配制的枸櫞酸緩沖液溶解)50 mg/kg;48小時后采尾血測空腹血糖，濃度大于16．7 mmol/L為模型復(fù)制成功［5］，該模型成功30只。

1．3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 取未造模的10只動物做正常對照組，造模成功的30只動物隨機(jī)分為糖尿病對照組(18只)、硝酸鑭給藥組(12只)，硝酸鑭給藥組每日灌胃硝酸鑭0．2 mg/kg，正常對照組及糖尿病對照組均每日給予等劑量生理鹽水，連續(xù)給藥1個月。在實(shí)驗(yàn)過程中糖尿病對照組動物死亡6只。

1．4 標(biāo)本收集 各組動物在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后次日清晨摘取眼球取血，然后迅速處死取出心臟固定于10%中性福爾馬林液中，每組隨機(jī)取10個心肌，常規(guī)石蠟包埋，切成5微米切片2張，分別進(jìn)行HE和免疫組化染色;另取部分心肌組織置于液氮中留做NF-κB及TNF-α的mRNA檢測。

1．5 指標(biāo)檢測

1．5．1 血糖、血脂檢測 血糖采用美國強(qiáng)生Surestep血糖儀測定;胰島素采用放免法測定，藥盒購自中國原子能研究所;血脂采用德國拜耳1650全自動生化分析儀測定。

1．5．2 血漿NF-κB及TNF-α 的測定 采用放射免疫法，藥盒購自南京生物工程有限公司。

1．5．3 心肌NF-κB及TNF-α 的mRNA表達(dá)的檢測引物序列由上海生物工程公司合成。NF-κB;上游引物5'-CATCGGGTTCCCATAAAG-3'，下游引物5'-TGGACACCTGGACGCTAA-3'，產(chǎn)物 359 bp;TNF-α:上游引物 5'-GGTGATCGGTGCCAACAAGGA-3'，下游引物 5'-CACGCTGGCTCAGCCACTG-3'，產(chǎn)物173 bp;β-actin:上游引物5'-GCCATGTACGTAGCCATGCA-3'，下 游 引 物 5'-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3'，產(chǎn)物375 bp。凝膠成像后用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1．5．4 心肌NF-κB及TNF-α 蛋白表達(dá)的檢測 采用免疫組化SP法。一抗購自Santa Crus公司，二抗、三抗和DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物工程公司。光鏡下觀察見棕黃色為陽性表達(dá)，結(jié)果分析采用Motic Images Advanced 3．2圖像分析系統(tǒng)測灰度值，灰度值越低，蛋白含量越高。

1．5．5 心肌纖維的病理檢測 光鏡下可見對照組大鼠心肌細(xì)胞排列緊密整齊、糖尿病組大鼠心肌細(xì)胞排列疏散紊亂間質(zhì)可見炎細(xì)胞浸潤、硝酸鑭組大鼠心肌細(xì)胞基本整齊緊密。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)過程中大鼠的一般狀態(tài)為對照組:大鼠體重明顯增加，精神狀態(tài)好，毛皮有光澤，反應(yīng)靈敏。糖尿病組:大鼠明顯消瘦，精神萎靡，毛皮無光澤，反應(yīng)遲鈍。硝酸鑭治療組:大鼠體重、精神狀態(tài)、毛皮光澤和反應(yīng)度較對照組差，但明顯好于糖尿病組。

2．1 各組血糖、血脂、血漿NF-κB及TNF-α 的的比較 與對照組和硝酸鑭治療組比較，糖尿病模型組血糖、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、NF-κB 及TNF-α的含量明顯增高(P＜0．01);硝酸鑭治療后上述指標(biāo)均顯著下降(P＜0．01);見表1。

2．2 各組大鼠心肌NF-κB及TNF-α的mRNA表達(dá)的比較 與對照組和硝酸鑭治療組比較，糖尿病模型組大鼠心肌NF-κB及TNF-α的mRNA含量明顯增高(P＜0．01);硝酸鑭治療后上述指標(biāo)均顯著下降(P＜0．01);見表2。

2．3 各組大鼠心肌NF-κB及TNF-α蛋白表達(dá)的比較 與對照組和硝酸鑭治療組比較，糖尿病模型組大鼠心肌 NF-κB及 TNF-α的蛋白含量明顯增高(P＜0．01);硝酸鑭治療后上述指標(biāo)均顯著下降(P＜0．01);光學(xué)顯微鏡下可見糖尿病組大鼠心肌NF-

κB及TNF-α陽性表達(dá)很強(qiáng)，對照組和硝酸鑭治療組大鼠心肌NF-κB及TNF-α陽性表達(dá)較弱，見表3，圖 1、2。

2．4 各組大鼠心肌纖維的病理改變 對照組大鼠心肌細(xì)胞排列緊密整齊、糖尿病組大鼠心肌細(xì)胞排列疏散紊亂間質(zhì)可見大量炎細(xì)胞浸潤、硝酸鑭組大鼠心肌細(xì)胞基本整齊緊密可見少量炎細(xì)胞浸潤;見圖3。

表1 各組血糖、血脂、血漿NF-κB及TNF-α的的比較(n=10， ±s)Tab．1 Comparision of blood biochem ical values and the concentration of TNF-α and NF-κB in different groups(n=10， ±s)

表1 各組血糖、血脂、血漿NF-κB及TNF-α的的比較(n=10， ±s)Tab．1 Comparision of blood biochem ical values and the concentration of TNF-α and NF-κB in different groups(n=10， ±s)

Note:1)P＜0．01 compared with control group and La(NO3)3 treatment group．

Groups Blood suger(mmol/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) TNF-α(ng/ml) NF-κB(ng/ml)Control 4．62±1．01 0．59±0．09 0．91±0．12 3．78±1．06 4．01±0．85 Diabeticmodel 20．46±3．241) 3．85±0．921) 4．13±1．021) 12．36±2．471) 10．95±1．511)La(NO3)3 treatment 5．86±1．32 0．86±0．15 1．04±0．17 4．33±1．51 4．85±0．91

表2 各組大鼠心肌NF-κB及TNF-α的mRNA表達(dá)的比較(n=10， ±s)Tab．2 NF-κB and TNF-α mRNA expression in cardiactissue in different groups(n=10， ±s)

表2 各組大鼠心肌NF-κB及TNF-α的mRNA表達(dá)的比較(n=10， ±s)Tab．2 NF-κB and TNF-α mRNA expression in cardiactissue in different groups(n=10， ±s)

Note:1)P ＜0．01 compared with control group and La(NO3)3 treatment group．

Groups TNF-α NF-κB Control 0．42±0．11 0．28±0．06 Diabetic model 0．84±0．091) 0．73±0．121)La(NO3)3 treatment 0．51±0．08 0．36±0．14

表3 各組大鼠心肌NF-κB及TNF-α蛋白表達(dá)的比較(n=10， ±s)Tab．3 NF-κB and TNF-α protein expression in cardiactissue in different groups(n=10，±s)

表3 各組大鼠心肌NF-κB及TNF-α蛋白表達(dá)的比較(n=10， ±s)Tab．3 NF-κB and TNF-α protein expression in cardiactissue in different groups(n=10，±s)

Note:1)P ＜0．01 compared with control group and La(NO3)3 treatment group．

Groups TNF-α(Grey value)NF-κB(Grey value)Control 168±2．58 173±3．26 Diabetic model 85±1．321) 76±2．811)La(NO3)3 treatment 154±2．49 169±2．65

圖1 心肌組織中NF-κB的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色 ，×400)Fig．1 NF-κB expression in cardiac tissue(Immunohistochem ical staining，×400)

3 討論

圖2 心肌組織中TNF-α的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色 ，×400)Fig．2 TNF-α expression in cardiac tissue(Immunohistochem ical staining，×400)

圖3 心肌細(xì)胞的組織病理改變(HE染色，×400)Fig．3 Histopathological changes in cardiac tissue(HE staining，×400)

稀土元素及其化合物具有特殊的物理化學(xué)性質(zhì)，因此其應(yīng)用范圍十分廣泛。多年來，隨著稀土在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)方面研究工作的不斷深入，逐步證實(shí)稀土是一種生物微量元素。因此稀土在生命科學(xué)中的地位日益顯現(xiàn)出來。可以預(yù)料，稀土在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用研究將日益受到重視，從而展示出其廣闊的應(yīng)用前景。我國稀土資源豐富，研究稀土對環(huán)境和人體健康的作用與影響，也是一個被廣泛涉獵的重要課題;研究工作從人體組織學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)方面入手，逐步進(jìn)入到稀土在預(yù)防和治療某些疾病方面，從而加快了稀土在臨床醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用進(jìn)程［6-8］。

糖尿病心肌病是糖尿病在心血管方面的并發(fā)癥，其臨床特征主要以左心室肥厚和舒張期功能受損為主，其病理表現(xiàn)為心肌細(xì)胞局灶性肥大、壞死，心肌間質(zhì)纖維化，膠原大量沉積。NF-κB是炎癥鏈的“基因開關(guān)”，參與許多細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控。糖尿病時蛋白質(zhì)的非酶氧化、晚期糖化終產(chǎn)物和其特異性受體結(jié)合、氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧族均可激活NF-κB［9］，使得 NF-κB 水平升高進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，通過口服低劑量的硝酸鑭能降低糖尿病大鼠心肌NF-κB的蛋白及mRNA的水平(P＜0．01)，提示降低 NF-κB 水平是硝酸鑭保護(hù)心肌組織的作用機(jī)制之一。

激活的NF-κB可啟動其下游基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致包括TNF-α在內(nèi)的一系列炎癥因子的過度表達(dá)。TNF-α具有多種生物學(xué)功能，是一種由巨噬細(xì)胞和活化的單核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有促進(jìn)血管內(nèi)血栓形成、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，它能使炎癥細(xì)胞粘附、聚集還能刺激機(jī)體產(chǎn)生自由基，造成機(jī)體的損傷［10］。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，通過口服低劑量的硝酸鑭能抑制機(jī)體產(chǎn)生TNF-α蛋白及mRNA的水平(P＜0．01)，從而改善心肌纖維的功能結(jié)構(gòu)，提示硝酸鑭對心肌組織有一定的保護(hù)作用。

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