謝基明 王玉珍 張 威 云小樂 鞏 培 劉竟然 趙世敏 康鴻斌 張和平

(內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，呼和浩特010010)

益生菌是指那些活的、在攝入一定數(shù)量后對(duì)宿主有益的微生物［1］。有研究表明，一些益生菌在預(yù)防和治療腸道病原菌感染方面積極有效［2，3］。特別地，植物乳酸菌K68可以顯著抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子 α(TNF-α)和前列腺素 E2(PGE2)的表達(dá)，從而保護(hù)葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎［4］。因?yàn)楦文c軸的存在，通過(guò)服用益生菌來(lái)預(yù)防肝臟疾病得到越來(lái)越多的關(guān)注。已經(jīng)有研究報(bào)道顯示，益生菌對(duì)于因飲酒、病毒感染以及代謝性疾病引起的慢性肝損傷有保護(hù)作用［5，6］。最近的研究表明，口服乳酸菌、雙歧桿菌和藍(lán)莓可以減輕LPS和D-氨基半乳糖(D-GalN)誘導(dǎo)的急性肝損傷。另外一項(xiàng)研究表明，植物乳酸菌與L-精氨酸聯(lián)合使用可以保護(hù)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝損傷［7］。然而其中機(jī)制尚不明確。

Lactobacillus Casei Zhang(L.Casei Zhang)是從馬奶酒中分離到的一株新的乳酸菌。該菌表現(xiàn)出良好益生菌的特性，如耐酸、耐膽汁、能夠在胃腸道定植［8］。我們以前的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，L.Casei Zhang能夠促進(jìn)小鼠分泌 IgA和 IFN-γ［9］。在本實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)中以LPS/D-GalN腹腔注射建立大鼠肝損傷模型，研究L.Casei Zhang對(duì)急性肝損傷的保護(hù)作用研究。進(jìn)一步地，我們探索了L.Casei Zhang發(fā)揮保肝作用的分子機(jī)制。本研究為開發(fā)益生菌 L.Casei Zhang的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑 LPS(O55:B5)和 D-GalN購(gòu)自Sigma公司。TLR4、p-ERK抗體購(gòu)自Cell Signaling公司。PPAR-γ和actin抗體購(gòu)自 Santa Cruz公司。TNF-α酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒購(gòu)自R＆D公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taq酶，購(gòu)自大連寶生物公司。NO測(cè)定試劑盒為南京建成生物公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠，體重120～140 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。22℃恒溫房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)顆?；旌巷暳?由內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物中心提供)喂養(yǎng)，自由飲水。購(gòu)買動(dòng)物適應(yīng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥 48只Wistar大鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照組(CTRL)，模型組(L/G)，益生菌組(L/G+LCZ)，地塞米松組(L/G+DXM)。通過(guò)腹腔注射 LPS(50 μg/ml)與D-GalN(300 mg/kg)建立急性肝損傷模型。益生菌組在建模前30天每日每只大鼠灌服1×109CFU益生菌L.Casei Zhang。地塞米松組在造模前腹腔注射地塞米松(10 mg/kg)。

1.3.2 標(biāo)本采集 造模后16小時(shí)處死大鼠，切開腹部，下腔靜脈取血，切取肝臟右葉4%多聚甲醛固定。其余肝臟液氮凍存。

1.3.3 組織病理學(xué)分析 多聚甲醛固定肝臟組織48小時(shí)后，進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色。采用盲法由病理醫(yī)生觀察組織病理學(xué)變化。

1.3.4 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片(5 μm)經(jīng)常規(guī)脫蠟水化后，用免疫組織化學(xué)SP法測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟組織中TLR4和p-ERK的表達(dá)水平。TLR4工作濃度為1∶50，p-ERK工作濃度為 1∶100。SP試劑盒購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)公司。具體操作方法參照SP免疫組織化學(xué)試劑盒。

1.3.5 PPAR-γ 表達(dá)的檢測(cè) 采用TRIZOL法提取肝臟組織的總RNA。RNA完整性通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)OD260和OD280的吸光度，計(jì)算RNA的濃度。1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA。以sence 5'-GGAAGCCCTTTGGTGACTTTATGG-3'和antisence 5'-GCAGCAGGTTGTCTTGGATGTC-3'為 PPAR-γ 引物;以 sence 5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3'和 antisence 5'-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3'為GAPDH引物做PCR。肝臟組織中PPAR-γ蛋白的表達(dá)采用Western blot方法，具體方法參見文獻(xiàn)［10］。

1.3.6 其他檢測(cè)指標(biāo) (1)ALT和AST。血液離心后收集血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中ALT和AST水平。(2)TNF-α。肝臟組織勻漿后，采用ELISA試劑盒檢測(cè)勻漿上清中TNF-α的表達(dá)水平。(3)NO。采用NO測(cè)定試劑盒檢測(cè)肝臟勻漿上清中NO的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS17.0軟件進(jìn)行ANOVA分析，P＜0.05時(shí)認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 L.Casei Zhang對(duì)急性肝損傷大鼠血清ALT和AST以及肝臟中TNF-α和NO表達(dá)的影響 從表1可以看出，與對(duì)照組相比，腹腔注射LPS與D-GalN后血清ALT和AST水平顯著增高(P＜0.01)，說(shuō)明急性肝損傷造模成功。與模型組相比，益生菌組和地塞米松組的ALT和AST水平顯著降低。檢測(cè)肝臟組織中炎性因子TNF-α和NO也發(fā)現(xiàn)，益生菌組與地塞米松組肝臟中TNF-α和NO表達(dá)水平與模型組相比也顯著降低(P＜0.01)。

2.2 L.Casei Zhang減輕急性肝損傷大鼠肝臟病變由圖1可以看出，對(duì)照組(CTL)大鼠肝臟組織正常，肝小葉結(jié)構(gòu)可辨，肝索排列整齊;模型組(L/G)的大鼠肝臟肝索排列紊亂，出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死灶。益生菌治療組(L/G+LCZ)僅出現(xiàn)部分肝細(xì)胞壞死，而且肝臟出現(xiàn)巨噬細(xì)胞增生性結(jié)節(jié)，表明益生菌有促進(jìn)肝臟修復(fù)的功能。地塞米松組(L/G+DXM)大鼠的肝臟細(xì)胞質(zhì)均勻，個(gè)別區(qū)域有細(xì)胞壞死灶。

表1 L.Casei Zhang對(duì)急性肝損傷大鼠ALT、AST、TNF-α和NO表達(dá)的影響Tab.1 Effects of L.Casei Zhang on the expression of ALT，AST，TNF-α and NO

圖1 肝臟切片HE染色的病理學(xué)改變(×400)Fig.1 Histological alteration of hematoxylin-eosin-stained liver sections(×400)

2.3 L.Casei Zhang對(duì)急性肝損傷大鼠肝臟TLR4表達(dá)的影響 為了進(jìn)一步探索益生菌 L.Casei Zhang保護(hù)急性肝損傷大鼠的機(jī)制，我們檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)各組大鼠肝臟組織中TLR4的表達(dá)水平。從圖2可以看出，模型組(L/G)TLR4的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(CTRL)。益生菌和地塞米松處理后，TLR4的表達(dá)水平顯著下降，表明益生菌以及地塞米松保護(hù)大鼠急性肝損傷與下調(diào)TLR4的表達(dá)有關(guān)。

2.4 L.Casei Zhang對(duì)急性肝損傷大鼠肝臟p-ERK表達(dá)的影響 鑒于TLR4信號(hào)通路活化后會(huì)活化下游的MAPK通路，我們隨后檢測(cè)了MAPK通路中的ERK的磷酸化水平。從圖3可以看出，與TLR4的表達(dá)增高相一致，模型組(L/G)的p-ERK表達(dá)水平明顯增高。與模型組相比，益生菌組(L/G+LCZ)和地塞米松(L/G+DXM)的p-ERK表達(dá)顯著降低，表明益生菌和地塞米松發(fā)揮保肝作用與降低ERK的磷酸化水平有關(guān)。

圖2 L.Casei Zhang降低急性肝損傷大鼠肝臟TLR4的表達(dá)(×400)Fig.2 L.Casei Zhang reduced the hepatic TLR4 expression in rats with acute liver injury(×400)

圖3 L.Casei Zhang降低急性肝損傷大鼠肝臟平p-ERK的表達(dá)(×200)Fig.3 L.Casei Zhang reduced the hepatic p-ERK expression in rats with acute liver injury(×200)

2.5 L.Casei Zhang對(duì)急性肝損傷大鼠肝臟PPAR-γ表達(dá)的影響 我們檢測(cè)了肝臟組織中PPAR-γ的表達(dá)水平。與TLR4和p-ERK的表達(dá)增高相反，LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷大鼠肝臟的PPAR-γ的mRNA與蛋白水平都顯著降低。在益生菌與地塞米松處理后，PPAR-γ的mRNA和蛋白表達(dá)有所恢復(fù)，表明益生菌與地塞米松通過(guò)上調(diào)PPAR-γ的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用。

圖4 L.Casei Zhang上調(diào)急性肝損傷大鼠肝臟平PPAR-γ的表達(dá)Fig.4 L.Casei Zhang up-regulates PPAR-γ expression in rats with acute liver injury

3 討論

LPS聯(lián)合D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷模型是一種非常理想的動(dòng)物模型，因?yàn)樵撃Ｐ团c由內(nèi)毒素血癥以及敗血癥誘發(fā)的肝炎的臨床表現(xiàn)非常相似。在該動(dòng)物模型中，由于血液中LPS的存在，導(dǎo)致機(jī)體的天然免疫應(yīng)答系統(tǒng)被過(guò)度活化，從而產(chǎn)生過(guò)量的前炎癥因子，加速了肝損傷進(jìn)程。在LPS誘發(fā)的前炎性因子中，TNF-α與肝細(xì)胞的壞死以及肝衰竭的發(fā)生密切相關(guān)［11］。此外，LPS/D-GalN誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧也是急性肝衰竭病因之一［12］。因此有效控制TNF-α以及活性氧的產(chǎn)生是預(yù)防以及治療急性肝損傷的有效措施。我們的研究表明，L.Casei Zhang能保護(hù)LPS/D-GalN誘導(dǎo)的肝損傷，表現(xiàn)為降低血清中ALT和AST水平，以及降低肝臟TNF-α和NO的表達(dá)。在組織病理學(xué)水平我們也證實(shí)，L.Casei Zhang顯著改善了肝臟的病理?yè)p傷。在本實(shí)驗(yàn)中，地塞米松作為陽(yáng)性對(duì)照藥物來(lái)治療急性肝損傷。盡管L.Casei Zhang的保護(hù)作用不及地塞米松，但是，本實(shí)驗(yàn)中采用的大劑量的地塞米松(10 mg/kg)會(huì)引起嚴(yán)重的副作用。因此，益生菌L.Casei Zhang具有潛在的保肝作用，有待于進(jìn)一步開發(fā)。

在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們著重探討了益生菌L.Casei Zhang發(fā)揮保肝作用的機(jī)制。我們檢測(cè)了肝臟組織中TLR4以及TLR4信號(hào)通路的變化。以前的研究表明，TLR4信號(hào)通路在肝損傷病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［13］。此外，在LPS/D-GalN誘導(dǎo)的肝損傷過(guò)程中TLR4的表達(dá)水平增高［14］。我們的研究結(jié)果與該結(jié)果一致。然而，在益生菌組以及地塞米松組TLR4的表達(dá)水平顯著下調(diào)。與此結(jié)果一致的是，TLR4下游信號(hào)通路中的ERK通路中，ERK的磷酸化水平也顯著降低，表明益生菌L.Casei Zhang是通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮保肝作用的。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是一類能被過(guò)氧化物酶體增殖物激活的核內(nèi)受體。亞家族之一的PPAR-γ可以在多個(gè)水平調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多條炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其中，PPAR-γ對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的抑制作用是其發(fā)揮抗炎效應(yīng)的分子基礎(chǔ)［15］。我們的研究表明，在LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷過(guò)程中，PPAR-γ的表達(dá)下調(diào)。然而益生菌和地塞米松作用后，PPAR-γ和表達(dá)水平有所上調(diào)。益生菌L.Casei Zhang能夠促進(jìn)PPAR-γ的表達(dá)是本文的新發(fā)現(xiàn)，對(duì)于闡明其作用機(jī)理提供了新的線索。

總之，我們的結(jié)果顯示，益生菌 L.Casei Zhang對(duì)LPS/D-GalN誘導(dǎo)的肝損傷作用有保護(hù)作用。這種保護(hù)作用與下調(diào)TLR4以及TLR4信號(hào)通路、與上調(diào)PPAR-γ的表達(dá)有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，益生菌L.Casei Zhang對(duì)于肝臟感染性疾病有潛在的預(yù)防作用。

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