王 剛 王海燕 張 華 賀菊香 吉利賓 楊歆睿 (青海大學醫(yī)學院病理學教研室，西寧 810001)

雪靈芝(Arenaria kansuensis)為青藏高原特有的石竹科蚤綴屬草本植物，分布于海拔4 000米以上的高山草甸和礫石帶。雪靈芝的藏藥名為“阿仲嘎?！?，意為“采天地靈氣之人間仙草”，以全草入藥。據(jù)藏醫(yī)典籍記載雪靈芝具有“治療胃腸之潰瘍、膨脹、癌癥、瘰疬并能健胃助消”［1］。近年來國內(nèi)研究表明，雪靈芝具有抗炎、抗氧化、促消化以及對二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌具有預防作用［2-5］。本研究組的前期研究顯示，在一定的濃度范圍內(nèi)，雪靈芝水提物對體外培養(yǎng)的胃癌細胞系，具有增殖抑制作用。本文通過觀察雪靈芝水提物對體外培養(yǎng)小鼠脾淋巴細胞增殖水平以及小鼠脾淋巴細胞和人PBMC中Th1型細胞因子表達的影響，探索雪靈芝是否對發(fā)揮抗腫瘤作用的免疫細胞及細胞因子具有激活作用。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 動物與細胞 清潔級昆明小鼠，4～6周齡，體重(20±2)克，購自青海省地病所實驗動物中心;健康人外周血采自研究組工作人員。

1．1．2 主要試劑與儀器 雪靈芝水提物凍干粉劑由本實驗室制備，凍干粉劑用PBS溶解(濃度4 mg/ml);四氮唑鹽(MTT)、胰蛋白酶、RPMI1640培養(yǎng)基均購自Gibco公司;胎牛血清購自Hyclone公司;刀豆蛋白(ConA)、植物血凝素(PHA)及二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司;紅細胞裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所;小鼠IL-2與IFN-γ的ELISA試劑盒購自eBioscience公司;Trizol購自Invitrogen公司;AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶購自Promega公司;SYBR Green實時定量PCR試劑盒購自QIAGEN公司;熒光定量PCR儀(FQD-48A型，杭州博日科技有限公司);酶標儀(Rayto RT-6000型，深圳雷杜生命科學股份有限公司)。

1．2 方法

1．2．1 小鼠脾淋巴細胞懸液制備 頸椎脫臼法處死小鼠，75%酒精浸泡，無菌條件下分離脾臟，置皿中剔除脂肪和結(jié)締組織，將脾組織研碎后用生理鹽水混懸，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾，收集濾液，1 500 r/min離心5分鐘后棄上清，加入3倍體積紅細胞裂解液，置冰上裂解1分鐘，4℃離心棄上清后重復裂解一次，用含2%小牛血清Hank's液洗滌離心細胞兩次，臺盼藍染色測細胞活力≥95%，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基按2×106cells/ml制備細胞懸液。

1．2．2 四氮唑鹽(MTT)法檢測小鼠脾淋巴細胞增殖 按100μl/孔接種小鼠脾淋巴細胞懸液于96孔培養(yǎng)板，各孔加入含ConA(終濃度1μg/ml)培養(yǎng)液50μl;各處理組每孔加入含相應濃度雪靈芝水提物的培養(yǎng)液50μl，對照組(0 mg/ml組)加入等量培養(yǎng)液，每組設(shè)5復孔。37℃ 5%CO2培養(yǎng)44小時，每孔加20μl MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。小心吸棄上清，各孔加入150μl DMSO，振蕩溶解5分鐘，酶標儀檢測490 nm波長OD值，結(jié)果以刺激指數(shù)(SI)表示:SI=實驗組OD值/對照組OD值。

1．2．3 體外培養(yǎng)小鼠脾淋巴細胞上清中IL-2及IFN-γ水平檢測 按1 ml/孔接種小鼠脾淋巴細胞懸液于24孔培養(yǎng)板，各孔加終濃度為1μg/ml的ConA;處理組加入相應濃度雪靈芝水提物，對照組(0 mg/ml組)加入等量培養(yǎng)液。培養(yǎng)48小時后離心收集培養(yǎng)上清，－70℃保存待測。IL-2及 IFN-γ ELISA檢測嚴格按試劑盒說明書操作。

1．2．4 人PBMC中Th1細胞因子mRNA表達檢測健康人外周靜脈血經(jīng)60%Percoll密度梯度離心，分離人PBMC，PBS洗滌2次，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為 1×106ml－1，按2 ml/孔，接種于6孔板，各孔加入終濃度5μg/ml的PHA。處理孔加入相應濃度雪靈芝水提物，對照孔(0 mg/ml)加入等量培養(yǎng)液。培養(yǎng)8小時后收集細胞，Trizol法抽提總RNA并合成cDNA第一鏈。配制25 μl PCR 反應體系:ddH2O 16 μl，10×PCR 緩沖2．5 μl，dNTP Mix(Each 2．5 mmol/L)2 μl，MgCl2(25 mmol/L)1．5 μl，Taq 酶(5 U/μl)0．2 μl，cDNA 1 μl、上、下游引物(表 1，10 μmol/L)各 1 μl;經(jīng)94℃變性5分鐘，94℃ 30秒，55℃ 45秒，72℃ 45秒擴增33個循環(huán)，72℃延伸5分鐘。擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳并觀察拍照。配制20μl熒光定量 PCR體系:ddH2O 7μl，2×QuantiFast SYBR Green PCR 預混液 10 μl，cDNA 1 μl，上、下游引物(10μmol/L)各1μl。按95℃變性5分鐘，95℃ 15秒，60℃ 45秒(測熒光1次)擴增40個循環(huán);之后從60℃至95℃，以0．2℃臺階升溫，進行熔解曲線分析。各組樣品設(shè)3復孔，以管家基因GAPDH為內(nèi)參照，以對照組作標準校比，2－ΔΔCt法進行相對定量分析。

1．3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19軟件進行統(tǒng)計學處理，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，采用LSD法進行顯著性檢驗，檢驗水準為 α=0．05。

表1 引物序列與產(chǎn)物大小Tab．1 Primer sequence and product size

2 結(jié)果

2．1 雪靈芝水提物對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響MTT法檢測結(jié)果顯示，0．05～0．4 mg/ml雪靈芝水提物處理組 SI高于對照組(P＜0．05)，同時0．025 ～0．4 mg/ml處理組 SI高于 0．8 mg/ml組(P＜0.05)，其中 0．2 mg/ml組 SI為 1．98±0．51(圖1)。

2．2 雪靈芝水提物對小鼠脾淋巴細胞分泌Th1型的影響 ELISA檢測結(jié)果顯示，0．05～0．1 mg/ml雪靈芝水提物處理組小鼠脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中IL-2水平明顯高于對照組(P＜0．05);而 0．4 mg/ml雪靈芝水提物處理組IFN-γ水平明顯高于對照組(P＜0．05，表2)。

圖1 雪靈芝水提物對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響Fig．1 The effect of AKAE on proliferation of mice spleen lym phocytes

表2 不同濃度雪靈芝水提物對小鼠脾淋巴細胞分泌IL-2及 IFN-γ 的影響 (pg/m l， ±s，n=5)Tab．2 The effect of different concentration AKAE on IL-2 and IFN-γ production of mice spleen lym phocytes(pg/m l， ±s，n=5)

表2 不同濃度雪靈芝水提物對小鼠脾淋巴細胞分泌IL-2及 IFN-γ 的影響 (pg/m l， ±s，n=5)Tab．2 The effect of different concentration AKAE on IL-2 and IFN-γ production of mice spleen lym phocytes(pg/m l， ±s，n=5)

Note:Compared with 0 mg/ml group，1)P＜0．05．

Concentration(mg/ml) IL-2 IFN-γ 0 55．88±7．20 29．11±4．67 0．05 155．9±29．641) 42．37±6．82 0．1 371．95±82．111) 45．68±9．11 0．2 32．47±5．59 48．93±9．37 0．4 19．32±4．53 87．70±16．541)

2．3 雪靈芝水提物對人PBMC中 NF-κB p65、IL-2及IFN-γmRNA表達的影響 RT-PCR擴增出與預期大小一致的 NF-кB p65、IL-2及 IFN-γ 條帶;熒光實時定量PCR結(jié)果顯示，0．2mg/ml雪靈芝水提物處理組IL-2 mRNA表達水平較對照組明顯升高;0.1 mg/ml和0．2 mg/ml處理組 NF-кB p65 及 IFN-γmRNA表達水平明顯高于對照組。0．2 mg/ml處理組的 NF-кB p65、IL-2及 IFN-γ 相對表達量，分別為185．75±19．7、4．31±0．05 和 36．67±5．48。熔解曲線分析顯示，3種擴增產(chǎn)物峰值單一，說明沒有引物二聚體和非特異性條帶形成(圖2)。

3 討論

雪靈芝的藥用研究始于上世紀末，國內(nèi)研究者進行的植化研究顯示，雪靈芝含有多糖、三萜皂苷、β-咔波啉生物堿及環(huán)肽等活性物質(zhì)［6］。在免疫相關(guān)的研究方面，彭寶珠等［2］通過巴豆油致小鼠耳腫脹、蛋清/角叉菜膠致大鼠足腫脹等炎癥模型以及觀察小鼠胸腺、脾臟及淋巴結(jié)重量變化的實驗研究，顯示雪靈芝具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用;李鳳文等［7］研究報道，雪靈芝具有促進小鼠脾細胞增殖、增強小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應、提高小鼠抗體生成細胞數(shù)和小鼠血清溶血素水平以及增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力等免疫增強作用。

本課題組之前進行的體外抑瘤研究顯示，雪靈芝水提物在0．1～0．8 mg/ml濃度范圍，對體外培養(yǎng)人胃癌MG803細胞增殖呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性抑制效應，IC50=(0．134±0．005)mg/ml(另文報道)。由此，本文為了解雪靈芝水提物在上述抑瘤有效濃度下，是否對與機體抗腫瘤免疫密切相關(guān)的淋巴細胞增殖和Th1型細胞因子表達具有促進作用，進行了探索。

首先，淋巴細胞中Th1型T細胞亞群通過產(chǎn)生IL-2、IFN-γ及IL-12等細胞因子，對巨噬細胞吞噬功能、DC細胞成熟、NK細胞與CTL細胞毒作用發(fā)揮正性調(diào)節(jié)，是機體抗腫瘤免疫的主要執(zhí)行者。本研究顯示，在0．025～0．4 mg/ml濃度范圍，雪靈芝對小鼠脾淋巴細胞增殖具有明顯促進作用。其中0．025～0．2 mg/ml處理組 SI呈濃度依賴性升高，0.2 mg/ml組SI達1．98;然而，隨雪靈芝作用濃度進一步增加，小鼠脾淋巴細胞增殖水平開始呈下降趨勢，0．8 mg/ml處理組 SI僅為 0．82，明顯低于其他處理組。這種藥物作用濃度與細胞增殖水平之間的非線性關(guān)系，提示雪靈芝對淋巴細胞增殖可能具有與濃度高低密切相關(guān)的雙向調(diào)節(jié)作用。

圖2 雪靈芝水提物對人PBMC中IL-2及IFN-γm RNA表達的影響Fig．2 The effect of AKAE on m RNA expression of p65，IL-2 and IFN-γ in human PBMC

其二，ELISA檢測結(jié)果顯示，在小鼠脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中，0．5 mg/ml和 0．1 mg/ml組 IL-2 水平、0．4 mg/ml組IFN-γ水平均高于對照組;實時定量PCR結(jié)果顯示，0．2 mg/ml處理組人PBMC的IL-2 mRNA表達明顯升高，0．1～0．2 mg/ml組人 PBMC的IFN-γ和p65 mRNA表達顯著升高。由于p65蛋白是構(gòu)成核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的主要亞基，p65的升高可促進NF-κB核轉(zhuǎn)位，在Th0細胞向Th1分化及表達 IL-2、IFN-γ的過程中具有正反饋調(diào)節(jié)作用［8-10］。提示雪靈芝可能通過 NF-κB信號通路，糾正Th1/Th2偏移，增強機體抗腫瘤免疫。

綜合上述淋巴細胞增殖和細胞因子表達的研究結(jié)果，我們認為，0．05 ～0．4 mg/ml是雪靈芝激活淋巴細胞增殖、促進Th1細胞因子表達，從而發(fā)揮抗腫瘤免疫的最佳效應濃度范圍，而這一范圍與我們前述的體外抑瘤效應濃度高度重合。這為進一步開展荷瘤鼠研究，探討雪靈芝是否具有體內(nèi)腫瘤抑制與免疫激活雙重作用，提供了依據(jù)。

1 中國科學院西北高原生物研究所．藏藥志［M］．西寧:青海人民出版社，1991:449．

2 彭寶珠，馮偉力，王利彥et al．藏藥雪靈芝對炎癥和免疫功能的影響［J］．中國中藥雜志，1991;16(6):363-366，383．

3 付 翔，陳 薇，段小群et al．雪靈芝提取物清除羥自由基和抑制脂質(zhì)過氧化作用［J］．中國中醫(yī)藥信息雜志，2010;17(7):35-36．

4 姚思宇，趙 鵬，劉榮珍et al．西藏雪靈芝促進消化作用實驗研究［J］．中國應用生理學雜志，2007;23(3):332-333，364．

5 趙 鵬，姚思宇，王彥武et al．雪靈芝對二乙基亞硝胺誘導大鼠肝癌組織細胞的抑制作用［J］．中國組織工程研究與臨床康復，2007;11(38):7553-7555．

6 雷 寧，杜樹山，李 林et al．藏藥甘肅蚤綴的化學成分研究Ⅰ［J］．中國中藥雜志，2007;32(10):918-920．

7 李鳳文，趙 鵬，劉榮珍et al．雪靈芝調(diào)節(jié)小鼠免疫功能作用的實驗研究［J］．中國熱帶醫(yī)學，2007;7(11):1999-2000，2020．

8 Corn R A， Aronica M A，Zhang F et al．T cell-Intrinsic requirement for NF-кB induction in postdifferentiation IFN-γ production and clonal expansion in a Th1 response［J］．J Immunol，2003;171(4):1816-1824．

9 Ozato K，Tsujimura H，Tamura T．Toll-like receptor signaling and regulation of cytokine gene expression in the immune system［J］．Biotechniques，2002;10:66-68，70，72．

10 Lederer JA，Liou JS，Kim S et al．Regulation of NF-kappa B activation in T helper 1 and T helper 2 cells［J］．J Immunol，1996;156(1):56-63．