謝永平，魏曉瑞，李 軍，陶 立，閉炳芬，韋志鋒，彭 昊，陳澤祥，楊 威＊，王曉麗

（1.廣西獸醫(yī)研究所／廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001；2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005）

水牛奶相對(duì)于其他品種的牛奶其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高，是適合人類飲用的高級(jí)營(yíng)養(yǎng)食品［1］。近幾年來(lái)，廣西地方政府鼓勵(lì)發(fā)展奶水牛業(yè)為重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)，奶水牛存欄量大幅度增加。隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidi-um）是一種廣泛寄生于人類、哺乳動(dòng)物、禽類、爬行動(dòng)物的寄生蟲(chóng)，可引起人和動(dòng)物的腹瀉，嬰兒或免疫功能低下或缺陷者可因嚴(yán)重腹瀉而死亡，畜禽動(dòng)物也會(huì)因長(zhǎng)期腹瀉而影響生產(chǎn)性能［2］。目前，尚無(wú)對(duì)廣西奶水牛隱孢子蟲(chóng)感染的報(bào)道，查明廣西奶水牛隱孢子蟲(chóng)的感染情況具有獸醫(yī)公共衛(wèi)生安全意義。我國(guó)牛隱孢子蟲(chóng)病首次報(bào)道于1985年，由周圣文等在黑龍江調(diào)查發(fā)現(xiàn)了犢牛隱孢子蟲(chóng)病，隨后在青海、甘肅、山東、安徽、河南、很多地區(qū)都對(duì)各地牛隱孢子蟲(chóng)的流行病學(xué)情況進(jìn)行了調(diào)查報(bào)道，且感染率較高［3-5］。研究表明慢性感染隱孢子蟲(chóng)的奶牛會(huì)出現(xiàn)體重下降，產(chǎn)奶量減少，給奶牛業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)隱孢子蟲(chóng)感染黑白花奶牛和農(nóng)村散養(yǎng)役用水牛的情況已進(jìn)行報(bào)道［6-8］，但對(duì)規(guī)模化養(yǎng)殖的奶水牛感染隱孢子蟲(chóng)的流行病學(xué)情況較少報(bào)道。為了查明廣西奶水牛隱孢子蟲(chóng)的感染情況，筆者于2012年對(duì)廣西主要規(guī)?；B(yǎng)殖奶水牛場(chǎng)進(jìn)行了隱孢子蟲(chóng)感染情況的調(diào)查。針對(duì)廣西奶水牛圈養(yǎng)放牧的飼養(yǎng)模式，應(yīng)用飽和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法檢測(cè)了廣西區(qū)8個(gè)奶水牛場(chǎng)1 009頭份不同日齡的奶水牛新鮮糞樣，應(yīng)用形態(tài)學(xué)和PCR 方法對(duì)分離的卵囊進(jìn)行蟲(chóng)種鑒定，該調(diào)查結(jié)果為廣西奶水牛隱孢子蟲(chóng)病的防治提供參考，同時(shí)為獸醫(yī)生物安全衛(wèi)生提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采集廣西南寧、來(lái)賓、百色、北海、貴港、欽州6個(gè)市8個(gè)奶水牛場(chǎng)1 009頭份奶水牛的新鮮糞便樣品，其中1歲以下的牛344頭份，1歲以上的牛665頭份。每份樣品采集50g左右，裝在干凈塑料袋里，登記編號(hào)，詳細(xì)記錄采集樣品的時(shí)間，采集地區(qū)，日齡等，放置于實(shí)驗(yàn)室4℃冰箱待檢。

1.1.2 試劑 飽和蔗糖溶液和改良抗酸染色液的配制參照陶立等［9］的方法。2×TaqPCR Master mix、DNA Marker為廣東東盛生物科技有限公司產(chǎn)品。糞便基因組DNA 提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器 光學(xué)顯微鏡，PCR 儀。

1.2 方法

1.2.1 飽和蔗糖溶液漂浮法 每份糞樣稱取10g，加入適量自來(lái)水充分?jǐn)噭?，分別經(jīng)過(guò)60目銅絲篩和260目尼龍篩過(guò)濾，濾液分別放入編好號(hào)的離心管中3 000r／min離心10min，棄上清，加入適量配置好的飽和蔗糖溶液，充分?jǐn)嚢?，使下層沉淀和蔗糖液充分混勻? 000r／min離心10min。用鐵絲吊環(huán)蘸取表層液膜，涂于載玻片上，制片后于400×光學(xué)顯微鏡下測(cè)量觀察。

1.2.2 改良抗酸染色法 取飽和蔗糖溶液漂浮法第一次離心后的糞便沉淀樣品，攪勻后蘸取沉淀樣品涂片，涂片自然干燥，甲醇固定8 min，滴加甲液染色5min～10min，水洗；滴加乙液脫色1 min～5min，水洗；滴加丙液復(fù)染1min～2min，水洗；晾干后于1 000×油鏡下觀察拍照。

1.2.3 隱孢子蟲(chóng)感染強(qiáng)度和卵囊形態(tài)學(xué)觀察鑒定

顯微鏡下未見(jiàn)到卵囊的標(biāo)記為“-”，每片中少于5個(gè)卵囊的記為“＋”，每個(gè)視野觀察到1～5個(gè)卵囊的記為“＋＋”，每個(gè)視野有6～10個(gè)卵囊的記為“＋＋＋”，超過(guò)10個(gè)卵囊記為“＋＋＋＋”。每個(gè)玻片觀察100個(gè)視野，在顯微鏡下仔細(xì)觀察卵囊的形態(tài)并測(cè)量100個(gè)卵囊大小，根據(jù)卵囊的長(zhǎng)短徑值計(jì)算卵囊形狀指數(shù)，結(jié)合觀察到的卵囊的形態(tài)特征鑒定隱孢子蟲(chóng)種。

1.2.4 隱孢子蟲(chóng)種類的PCR鑒定

1.2.4.1 卵囊純化的方法 隱孢子蟲(chóng)的卵囊純化采用蔗糖密度梯度離心法，按照體積比，以飽和蔗糖液為母液分別配置1∶1、1∶2、1∶2.5、1∶5的處理液，取離心管先加入1∶1蔗糖液純化，3 600r／min離心15min；收集卵囊液，以1∶2繼續(xù)純化收集卵囊；下層加入1∶2.5蔗糖溶液，中層加入1∶5蔗糖液，上層加入上一步純化的卵囊液，3 600r／min離心15min，收集卵囊液用蒸餾水稀釋后3 000r／min離心10min，收集沉淀加入重鉻酸鉀液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 卵囊DNA 的提取 取飽和蔗糖溶液純化后的卵囊，水洗3次，洗去重鉻酸鉀后取200 mg樣品，按照糞便基因組DNA 提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行隱孢子蟲(chóng)卵囊的DNA 提取。

1.2.4.3 PCR鑒定 參照彭昊等［10］建立的方法進(jìn)行隱孢子蟲(chóng)種類鑒定。PCR反應(yīng)結(jié)束后將PCR 產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 廣西奶水牛隱孢子蟲(chóng)的分離結(jié)果

通過(guò)檢測(cè)來(lái)自廣西8個(gè)奶水牛場(chǎng)1 009頭份不同日齡的奶水牛新鮮糞樣，其中1歲以下的牛344頭份，1歲以上的牛665頭份，僅發(fā)現(xiàn)1頭奶水牛感染陽(yáng)性，年齡在1.5歲左右，感染強(qiáng)度為“＋＋＋”，廣西奶水牛隱孢子蟲(chóng)的感染率僅0.1%。

2.2 分離株卵囊的形態(tài)特征及鑒定

在顯微鏡下觀察從奶水牛糞樣中分離到的隱孢子蟲(chóng)卵囊，其囊壁薄，光滑，無(wú)微孔，無(wú)極粒，無(wú)色，卵囊內(nèi)有月芽形的子孢子和1個(gè)殘?bào)w。飽和蔗糖溶液漂浮過(guò)后的隱孢子蟲(chóng)卵囊呈玫瑰紅色，周圍有淡綠色的折光帶，卵囊形狀為長(zhǎng)卵圓形（圖1）。改良抗酸染色后的隱孢子蟲(chóng)卵囊為卵圓形，卵囊呈深玫瑰紅色，卵囊對(duì)比分明。部分卵囊內(nèi)可見(jiàn)到彎曲的子孢子，大部分卵囊內(nèi)部子孢子為結(jié)構(gòu)模糊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖2）。卵囊（n＝100）平均大小7.58μm×5.30 μm（5.4μm～9.3μm×4.12μm～6.5μm），卵囊形狀指數(shù)1.40（長(zhǎng)／寬），與陶立等［13］報(bào)道的形態(tài)大小相似，可初步鑒定為安氏隱孢子蟲(chóng)（C.andersoni）。

圖1 飽和蔗糖液中奶水牛隱孢子蟲(chóng)卵囊形態(tài)（400×）Fig.1 The morphology observation of Cryptosporidium oocysts in buffalo after Shether’s sugar flotation（400×）

圖2 改良抗酸染色奶水牛隱孢子蟲(chóng)卵囊形態(tài)（1 000×）Fig.2 The morphology observation of Cryptosporidium oocysts in buffalo after modified acid-fast stain method（1 000×）

2.3 PCR鑒定結(jié)果

電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為263bp的目的片段，與預(yù)期的安氏隱孢子蟲(chóng)擴(kuò)增片段一致（圖3）。PCR 產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司完成測(cè)序，測(cè)序分析結(jié)果顯示此樣品為安氏隱孢子蟲(chóng)（C.andersoni）。

圖3 PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Identification of PCR products

3 討論

寄生于牛體的隱孢子蟲(chóng)有微小隱孢子蟲(chóng)（C.parvum），賴氏隱孢子蟲(chóng)（C.ryanae），安氏隱孢子蟲(chóng)（C.andersoni）和牛隱孢子蟲(chóng)（C.bovis）。安氏隱孢子蟲(chóng)主要感染青年牛和成年牛，導(dǎo)致產(chǎn)奶量降低，而其他癥狀不明顯。國(guó)外水牛感染隱孢子蟲(chóng)的種類多為混合感染［11］。我國(guó)水牛隱孢子蟲(chóng)感染種類主要是微小隱孢子蟲(chóng)和安氏隱孢子蟲(chóng)［3，10］。筆者通過(guò)調(diào)查檢測(cè)廣西8個(gè)奶水牛場(chǎng)1 009頭份不同日齡的奶水牛新鮮糞樣，僅發(fā)現(xiàn)1頭奶水牛感染陽(yáng)性，其卵囊通過(guò)分離純化后，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為安氏隱孢子蟲(chóng)（C.andersoni）。證實(shí)廣西奶水牛感染了安氏隱孢子蟲(chóng)，但感染率很低。

El-Khodery S A 等［7，11］采用ELISA 或改良齊尼氏法對(duì)水牛隱孢子蟲(chóng)感染的檢測(cè)結(jié)果表明，坦桑尼亞和埃及的水牛隱孢子蟲(chóng)病的感染率為14.0%～22.2%。孫濤等［5，8，12］采用飽和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法檢測(cè)結(jié)果表明，合肥、河南等地水牛隱孢子蟲(chóng)病的感染率為1.8%～16.73%。筆者應(yīng)用飽和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法調(diào)查廣西8個(gè)黑白花奶牛規(guī)模場(chǎng)1 731頭份，隱孢子蟲(chóng)的感染率為13.7%；此次筆者應(yīng)用相同方法檢測(cè)廣西8個(gè)奶水牛場(chǎng)的1 009頭份奶水牛隱孢子蟲(chóng)的感染率僅0.1%，說(shuō)明廣西奶水牛隱孢子蟲(chóng)感染率很低，究其原因可能與飼養(yǎng)方式和養(yǎng)殖場(chǎng)的歷史長(zhǎng)短有關(guān)。廣西奶水牛業(yè)是新興產(chǎn)業(yè)，在調(diào)查的養(yǎng)殖場(chǎng)中，廣西水牛研究所是廣西唯一的奶水牛的保種和選育單位，其下屬良種奶水牛場(chǎng)負(fù)責(zé)全區(qū)的奶水牛的供應(yīng)，該場(chǎng)在2010年和2012年2次隱孢子蟲(chóng)調(diào)查檢測(cè)中均為陰性；其他調(diào)查場(chǎng)都是近1年～2年才發(fā)展奶水牛養(yǎng)殖，場(chǎng)地新、環(huán)境衛(wèi)生好；奶牛場(chǎng)都采取公司加農(nóng)戶的方式進(jìn)行奶水牛推廣養(yǎng)殖，農(nóng)戶飼養(yǎng)的奶水牛養(yǎng)殖數(shù)量少，易于管理，養(yǎng)殖與經(jīng)濟(jì)效益掛鉤，農(nóng)戶責(zé)任心強(qiáng)，飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生條件做得更好更仔細(xì)。

隱孢子蟲(chóng)在人類中主要引起腹瀉，尤其對(duì)于免疫功能受損的病人及免疫力低下的人群或兒童引起嚴(yán)重的漸進(jìn)性腹瀉，加速免疫低下或免疫缺陷病人的死亡。安氏隱孢子蟲(chóng)是人獸共患隱孢子蟲(chóng)種類之一［11］。隱孢子蟲(chóng)的感染途徑主要是經(jīng)過(guò)糞-口感染，因此人獸共患傳播已成為隱孢子蟲(chóng)的重要傳播途徑之一［13］。文獻(xiàn)報(bào)道水源性污染已成為人感染隱孢子蟲(chóng)的主要途徑［14］，由于奶水牛飼養(yǎng)周期較長(zhǎng)，易感性強(qiáng)，排出卵囊時(shí)間較長(zhǎng)；而奶水牛又常在河邊放養(yǎng)，患病奶水牛的糞便中含有大量感染性卵囊；可傳播多種人獸共患的寄生蟲(chóng)卵囊，排入河流中，造成了當(dāng)?shù)氐耐猎春退葱晕廴?，可能引起人獸共患寄生蟲(chóng)的傳播，對(duì)人類和家畜健康造成很大的威脅。因此，本研究調(diào)查廣西地區(qū)奶水牛隱孢子蟲(chóng)的流行病學(xué)情況，分析當(dāng)?shù)馗腥镜碾[孢子蟲(chóng)種類和基因型，對(duì)有效預(yù)防和控制人和奶水牛隱孢子蟲(chóng)病的傳播提供理論依據(jù)，對(duì)當(dāng)?shù)氐娜诵蠼】稻哂兄匾墓残l(wèi)生學(xué)意義。

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