曹 玉，王晨靜，趙 霞，李存友，王宏廣，王春波，管華詩(shī)

(1中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，山東青島266100;2青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院;3青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

左卡尼汀(LC)，又叫左旋肉堿、肉毒堿、維生素BT，與其?；a(chǎn)物乙酰左卡尼汀(ALC)和丙酰左卡尼汀(PLC)等共同構(gòu)成人體內(nèi)的卡尼汀群，是動(dòng)物體內(nèi)脂肪代謝不可缺少的營(yíng)養(yǎng)素，在食品加工、動(dòng)物養(yǎng)殖、醫(yī)療保健等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［1］。目前，關(guān)于LC的研究多集中在牛、羊等肉類食品，在海洋產(chǎn)品中研究較少，而同時(shí)觀察海洋產(chǎn)品中LC及其代謝產(chǎn)物的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。斑玉螺、疣荔枝螺、海螺、鈍擬蟹守螺均為海洋中藥食兩用的海洋產(chǎn)品，是沿海地區(qū)居民餐桌上的常見(jiàn)食品。2012年5～12月，我們采用熒光衍生化高效液相色譜法(HPLC)對(duì)4種海螺中LC、ALC、PLC的含量進(jìn)行了檢測(cè)，以期為我國(guó)海洋螺類藥用資源的開(kāi)發(fā)以及沿海地區(qū)居民通過(guò)海洋食品攝入LC提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)儀器:Waters2695高效液相色譜儀、Waters474熒光檢測(cè)器(美國(guó) Waters公司)，HL130HS血液透析儀 (埃及 Haidylena公司)，METTLER AE240電子天平(博特勒—托利多儀器上海公司)，Milli-Q Biocel純水發(fā)生器［密理博(上海)貿(mào)易有限公司］，離心機(jī)(德國(guó)雅培公司)，MS1 Minishaker渦旋振蕩器(Minishaker公司)。藥品及試劑:LC、ALC、PLC、1-氨基蒽(1-AA)均購(gòu)自 Sigma 公司，1-乙基-(二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)購(gòu)自 Fluka公司，乙腈(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Honeywell International Inc，丙酮、乙醚、氯仿、乙酸銨等均為國(guó)產(chǎn)分析純。斑玉螺、疣荔枝螺、海螺、鈍擬蟹守螺均為鮮活海螺，購(gòu)自青島臺(tái)東水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 樣品提取及制備 ①樣品及空白樣品提取:分別取4種新鮮海螺肉50 g，加入3倍量的3%高氯酸溶液，勻漿機(jī)中勻漿3 min(3 000 r/min)，3 000 r/min離心10 min，取上清液，用 NaOH調(diào)整 pH為7.8。取5 mL，－20℃冷凍保存待測(cè)。其余樣品置入血液透析器中，4℃下用1.5%腹膜透析液1.5 mL/min透析24 h后分裝凍存，用于配置標(biāo)準(zhǔn)品。②衍生化試劑:取1-AA 160 mg，丙酮溶解至10 mL，即得EDC溶液。取EDC 1 600 mg，用0.01 mmol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 3.5)溶解至10 mL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線配置 分別取LC(9.88 mg)、ALC(4.79 mg)、PLC(6.39 mg)，用水溶解至 10 mL，精密量取適量，加入空白樣品溶液，配置混合標(biāo)準(zhǔn)液，其中 LC 濃度分別為 5、10、20、50、100、200、400、800 μmol/L，ALC 濃度分別為0.4、1、2、4、10、20、50、100 μmol/L，PLC 濃度分別為 0.2、0.5、1、2、5、10、25、50 μmol/L。

1.2.3 高效液相色譜條件 色譜柱:Hypersil C18柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm);流動(dòng)相:0.1 mol/L 乙酸銨—乙腈(67∶33);流速為1.0 mL/min;波長(zhǎng):Ex 248 nm，Em 418 nm;進(jìn)樣量:50 μL。

1.2.4 LC、ALC、PLC 含量檢測(cè) 取各樣本的標(biāo)準(zhǔn)樣和待測(cè)樣提取液100μL，加入500μL乙腈沉淀蛋白，10 900 r/min離心5 min，取上清液500μL，加入400μL磷酸緩沖液(pH 3.5)，20μL稀鹽酸(1 mol/L)，混勻后加入1-AA溶液100μL，緩慢加入100μL EDC，室溫避光衍生化30 min。然后用乙醚(3 mL)萃取2次，棄掉乙醚相，在水相中加入800 μL磷酸緩沖液(pH 9.1)，渦旋后用氯仿(3 mL)萃取2次，取水相400μL，加同等量的磷酸緩沖液(pH 3.5)，混勻后取50μL進(jìn)樣分析。取每種海螺的各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液6份，處理后進(jìn)樣分析，以峰面積的均值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)精密度、回收率、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行方法學(xué)考察，每種海螺分別取6份待測(cè)樣品，分別計(jì)算濃度，取平均值，得到待測(cè)樣品的濃度，計(jì)算每100 g樣品中含有LC、ALC、PLC的量。

2 結(jié)果

2.1 選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 取空白樣品、標(biāo)準(zhǔn)溶液、提取樣本處理后進(jìn)樣分析，得空白樣品色譜圖、標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖和待測(cè)樣本色譜圖(為鈍擬蟹守螺的色譜圖，其余三種產(chǎn)品色譜圖相似，略)。見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，在測(cè)定時(shí)間范圍內(nèi)，空白樣品無(wú)測(cè)定成分的干擾;標(biāo)準(zhǔn)溶液中 LC、ALC、PLC 分別在 7.233、10.328、14.137 min 出峰，峰形良好，分離完全，無(wú)干擾;待測(cè)樣本中分別在對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出相應(yīng)的成分。

圖1 鈍擬蟹守螺的LC、ALC和PLC高效液相色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 熒光衍生化HPLC精密度＜4%、回收率96% ～103%、穩(wěn)定性＜3.8%，證明該方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確、靈敏，能達(dá)到檢測(cè)的目的。其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程以及檢測(cè)限、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

2.3 各樣品LC、ALC、PLC含量 見(jiàn)表2。

3 討論

LC是由俄國(guó)科學(xué)家Guliewitsch和Krimberg于1905年在肌肉提取物中發(fā)現(xiàn)的［2］，并鑒定其結(jié)構(gòu)式為L(zhǎng)-β-羥基-γ-三甲氨丁酸。它的基本功能是與長(zhǎng)鏈脂肪酸結(jié)合，帶動(dòng)長(zhǎng)鏈脂肪酸向線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，使脂肪酸在線粒體酶的作用下發(fā)生β-氧化，再將脂肪酸β-氧化的產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)出線粒體，最終有利于脂肪的進(jìn)一步分解［3，4］。人體內(nèi)的卡尼汀群來(lái)源主要有內(nèi)源性和外源性兩種，內(nèi)源性的LC主要在肝、腎和大腦中合成［5］;外源性的主要來(lái)自藥物和肉類食品［6］，正常人體內(nèi)的LC 25%自身合成、75%來(lái)自食物，在動(dòng)物的骨骼肌中含量最高。1993年美國(guó)FDA專家委員會(huì)確認(rèn)LC安全、無(wú)毒，美國(guó)藥典第23版開(kāi)始收載LC原料和制劑。LC在醫(yī)療上主要用于治療慢性腎疾病引起的肉堿缺乏、心肌疾病和心率失常、調(diào)節(jié)血脂及血壓等，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病以及減肥和男性不育癥也有效果;作為保健品和食品添加劑可用于減肥、運(yùn)動(dòng)保健、抗衰老、嬰兒奶粉以及其他食品中;作為飼料添加劑添加在水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料中，可以提高生長(zhǎng)速度，降低飼料系數(shù)，改善魚(yú)肉品質(zhì)，提高魚(yú)類繁殖率［7］，市場(chǎng)潛力巨大。ALC經(jīng)ALC轉(zhuǎn)移酶在人體的腦、肝臟處被合成，能夠促進(jìn)線粒體在脂肪酸氧化過(guò)程中對(duì)乙酰輔酶A的攝取，增加乙酰膽堿的生成，并刺激蛋白質(zhì)和膜磷脂的合成。能夠迅速通過(guò)血腦屏障，改善神經(jīng)能量，修復(fù)神經(jīng)作用機(jī)制并調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿的生成，能夠有效治療和預(yù)防老年性癡呆。PLC為肉毒堿乙酰轉(zhuǎn)移酶刺激劑，可劑量依賴性擴(kuò)張微血管，選擇性的保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞不受組織缺氧或過(guò)氧化酶制劑引起的損傷。目前，臨床上主要用于充血性心力衰竭、外周血管疾病、間歇性跛行等疾病。隨著卡尼汀群的研究越來(lái)越受到重視，其臨床應(yīng)用亦越來(lái)越廣泛。

表1 四種海螺樣品的LC、ALC、PLC標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

表2 四種海螺樣品的LC、ALC、PLC含量(μmol/100 g)

本研究在前期［8，9］對(duì)血漿、尿液等樣品含量測(cè)定的基礎(chǔ)上，建立了從海螺肉中提取LC、ALC、PLC，并用熒光衍生化HPLC檢測(cè)其含量，樣本衍生化后色譜峰分離良好，干擾少，檢測(cè)時(shí)間短，且靈敏度高、檢測(cè)限低，且室溫條件下即可衍生化反應(yīng)，操作簡(jiǎn)便。經(jīng)精密度、穩(wěn)定性和回收率實(shí)驗(yàn)證明均能達(dá)到檢測(cè)的要求，適用于食品、藥品、組織以及治療性檢測(cè)需要。在方法學(xué)實(shí)驗(yàn)條件的探索過(guò)程中，考慮到四種海螺制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)均需要制備空白溶液以排除內(nèi)源性LC的干擾，本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上采用透析器透析方法制備各樣品卡尼汀群的空白溶液［8］?？瞻讟悠返纳V圖顯示，采用透析法可以有效去除內(nèi)源性LC的干擾及其樣本中其他未知物質(zhì)的干擾，符合本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)海洋產(chǎn)品的質(zhì)量要求。檢測(cè)結(jié)果顯示，鈍擬蟹守螺中 LC、ALC、PLC含量最高，其次為疣荔枝螺、斑玉螺，海螺中含量最低。提示沿海居民常食鈍擬蟹守螺可以攝取較多的LC、ALC和PLC，同時(shí)也為下一步通過(guò)提取制備卡尼汀群原料提供理論依據(jù)。

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