高 燕，肖長虹，潘 超，左芳芳，李凱琴

(南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣州510315)

類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)是臨床常見的一種以持續(xù) 性滑膜炎和多關(guān)節(jié)進行性軟骨、骨破壞為特點的自身免疫性疾病。三水白虎湯(SSBH)是我院治療活動期RA的經(jīng)驗方，前期研究結(jié)果顯示，SSBH含藥血清對滑膜成纖維細胞(FLS)增殖具有顯著抑制作用，72 h達到高峰［1］。2012年 9～12月，我們利用雙向凝膠電泳(2-DE)和質(zhì)譜技術(shù)分析了SSBH含藥血清體外培養(yǎng)RA患者的關(guān)節(jié)FLS蛋白表達圖譜，旨在尋找該方抑制FLS增殖的作用靶點，為其治療RA提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級SD雄性大鼠20只，體質(zhì)量(200±20)g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(粵)2011-0015?；そM織來自南方醫(yī)院確診的RA患者的膝關(guān)節(jié)。SSBH由南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供;DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(含 EDTA)(Hy-Clone，美國)，Vimentin單克隆抗體、CD68單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，inc.)，SP 免疫組化試劑盒(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，固相pH梯度干膠條(pH4-7NL，24 cm)、IPG膠條緩沖液購自美國通用公司;尿素、二硫蘇糖醇(DTT)、3-［(3-膽酰胺丙基)-二乙銨］-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、三羧基氨基甲烷、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、過硫酸銨、碘代乙酰胺、礦物油、甘油均為美國Sigma公司產(chǎn)品;硫脲為Fluka公司品;其余均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 SSBH含藥血清制備及大鼠分組 水煎SSBH 2次，混合2次煎取液進行濃縮，終濃度為含生藥2 g/mL。隨機將大鼠分為空白對照組(生理鹽水組)、SSBH組，每組10只。SSBH組給予2 mL SSBH灌胃，生理鹽水組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)給藥1周。采血前夜禁食、不禁水，次晨末次給藥90 min后腹主動脈采血，3 000 r/min離心10 min，取血清。56℃恒溫水浴槽水浴30 min滅活，0.22μm除菌濾膜抽濾除菌后，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 滑膜細胞原代培養(yǎng) 將滑膜組織剪成1 mm3大小，均勻排列于培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面，將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，向瓶中加入適量20%FBS完全培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);孵育4 h待組織塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，繼續(xù)靜置培養(yǎng);3～4 d鏡下可見組織塊周圍FLS渦旋狀成片生長后，去除組織塊后繼續(xù)培養(yǎng)，待滑膜細胞覆蓋培養(yǎng)瓶底面＞80%時，進行消化傳代。取傳3～6代的FLS，通過免疫細胞化學(xué)染色、倒置相差顯微鏡鑒定合格后備用。

1.2.3 滑膜細胞總蛋白抽提 每1.5×106個滑膜細胞加入100μL細胞裂解液，吹打使細胞與裂解液充分接觸，室溫放置1 h后，4℃ 40 000 g離心，吸取上清液為細胞總蛋白質(zhì)，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 滑膜細胞總蛋白分離及染色 取蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合加入到水化盤中，用鑷子去除預(yù)制IPG膠條上的保護層，將膠面朝下置于水化盤樣品溶液上。1 h之后加礦物油密封，于室溫條件下密封放置16 h。取出膠條吸去多余的液體，將膠條膠面向下放在聚焦槽內(nèi)，加覆蓋礦物油進行第一向等電聚焦電泳。聚焦完畢，取出膠條進行兩步平衡15 min。將膠條轉(zhuǎn)移到SDS-PAGE膠上行第二向SDS電泳，低電流(12 mA/gel/17 cm)，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流(或電壓)(24 mA/gel/17 cm)，待溴酚藍指示劑達到底部邊緣約1 cm時即可停止電泳。電泳結(jié)束后，取出凝膠采用銀染方法進行顯色。

1.2.5 圖像采集及圖譜分析 染色后的凝膠用UMAX PowerLook 1100透射掃描儀獲取圖像，將掃描后的凝膠放于4℃保存待用。選取在兩組圖譜中蛋白質(zhì)表達量相差3倍的點進行分析。

1.2.6 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜分析選取差異表達的27個蛋白點，從膠上切下置96孔培養(yǎng)板，經(jīng)乙腈脫水后，加入適量的胰蛋白酶，37℃酶解12 h，然后加入肽提取液，室溫振蕩30 min，收集提取液，干燥濃縮備用。將樣品和基質(zhì)充分混合后點樣于上樣靶，室溫干燥后進行圖譜采集，將蛋白點的肽質(zhì)量指紋圖譜、分子量和等電點數(shù)據(jù)輸入計算機，使用Mascot搜索引擎進行數(shù)據(jù)庫檢索。

2 結(jié)果

2.1 FLS的培養(yǎng)鑒定 在倒置顯微鏡下，所培養(yǎng)的細胞形態(tài)符合成纖維細胞的形態(tài)特征，呈紡錘狀、星形或梭形，部分可呈大多角形。細胞核邊界清楚，呈卵圓形，位于細胞的中間，核仁清晰。在FLS培養(yǎng)至第3代時，經(jīng)鏡下觀察，具有典型形態(tài)特征的樹突狀細胞，內(nèi)皮細胞、脂肪細胞、血管內(nèi)皮細胞基本消失，未見懸浮細胞。傳代至第3代及以上時，成纖維細胞樣細胞所占比例均＞98%。Vimentin、CD68免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，Vimentin染色陽性，胞質(zhì)內(nèi)見大量棕黃色顆粒，CD68染色陰性。

2.2 兩組FLS蛋白2-DE圖譜及質(zhì)譜鑒定 SSBH組和NS組FLS蛋白2-DE圖譜均出現(xiàn)差異蛋白質(zhì)點。在差異蛋白表達量超過3倍的蛋白質(zhì)點中，選取差異表達的27個蛋白點進行PMF分析，成功鑒定出25個點，將這些點經(jīng)Mascot數(shù)據(jù)庫共鑒定出包括表達上升的IL-1受體拮抗蛋白等共25種蛋白質(zhì)。見圖1。

圖1 兩組FLS蛋白2-DE圖譜

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，RA滑膜組織中除了炎性介質(zhì)IL-1、TNF-α、IL-6、IL-17 等外，還有抗炎型介質(zhì)如IL-10、IL-1Ra、TGF-β 等，它們可下調(diào)炎癥反應(yīng)。因此，RA可被看作是由促炎和抗炎介質(zhì)不平衡造成的一種疾病。IL-1Ra是IL-1家族中的一員，與IL-1α、IL-1β共同構(gòu)成了IL-1家族，主要由激活的單核/巨噬細胞產(chǎn)生，包含177個氨基酸殘基。IL-1Ra以4種同工蛋白的形式存在，即sIL-1Ra(可溶性IL-1Ra)和 3 種細胞內(nèi) IL-1Ra(iIL-1Ral、2、3)［2］。IL-1在RA發(fā)病過程中具有非常重要的作用，不僅參與了滑膜炎癥和血管翳的形成，而且還在骨與軟骨破壞、修復(fù)中起重要作用。因此，IL-1Ra通過與IL-1α、IL-1β競爭性結(jié)合靶細胞表面的Ⅰ型IL-1R，可以抑制后者的功能，同時IL-1Ra也可以阻斷滑膜細胞的PGE2的合成、軟骨細胞的膠原產(chǎn)生及軟骨基質(zhì)的降解等，所以IL-1Ra具有抗炎作用，也是迄今發(fā)現(xiàn)的惟一天然炎性細胞因子的抑制劑［3］。IL-1Ra與IL-1表達水平之間的平衡影響著RA的發(fā)生與發(fā)展狀態(tài)，很可能與IL-1Ra在體液循環(huán)時彌散于組織中，影響了IL-1的比率，需要更高濃度的IL-1Ra才有可能抑制IL-1對靶細胞的的生物功能。這樣，在局部組織中必須有足夠的IL-1Ra才能阻止IL-1的效應(yīng)。在體外，IL-IRa可封閉 IL-1的效應(yīng)，降低PGE2和膠原酶的產(chǎn)生，改變它們對蛋白多糖和軟骨合成的抑制［4］。

SSBH為臨床自擬驗方，以《千金藥方》犀角散和《廣濟總錄》白虎湯化裁而成，具有清熱除濕、祛風通絡(luò)、活血止痛的功效。本課題組前期［1］研究結(jié)果顯示，在設(shè)定的10% ～50%5個濃度含藥血清中，20% ～30%含藥血清抑制FLS增殖效應(yīng)最大。SSBH含藥血清作用于FLS 48 h后即表現(xiàn)出對細胞增殖的顯著抑制作用，72 h達到高峰。各項研究提示，SSBH可能具有抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、阻斷軟骨和骨質(zhì)侵蝕等多種藥理作用［5］，其作用機制包括:抑制基質(zhì)金屬蛋白酶、NF-κB在關(guān)節(jié)局部的表達;抑制TNF-α的產(chǎn)生;抑制FLS內(nèi)P38MAPK的激活［6］。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用為RA的研究提供了一個新的平臺。國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用2-DE和質(zhì)譜技術(shù)對RA患者血漿、滑膜組織、滑膜細胞的蛋白質(zhì)表達進行了研究，發(fā)現(xiàn)了多種在RA中特異表達的蛋白質(zhì)［7～9］。因此，本實驗采用20%含藥血清培養(yǎng)72 h后達最大抑制細胞增殖效應(yīng)的滑膜細胞進行細胞總蛋白的抽提，利用2-DE和質(zhì)譜技術(shù)分析SSBH含藥血清體外培養(yǎng)的RA患者FLS蛋白表達圖譜，通過對生理鹽水組的表達差異進行分析，尋找該方在最佳作用濃度和時間下抑制滑膜細胞增殖的作用靶點。結(jié)果顯示，RA FLS中IL-1Ra蛋白的表達較正常組比較明顯上升，提示SSBH可能通過上調(diào)IL-1Ra的表達，IL-1Ra競爭性抑制IL-1的效應(yīng)，從而起到抑制FLS增殖的作用，這可能是SSBH治療RA的藥理機制之一，但是該蛋白的功能還需進一步進行驗證，要具體闡明SSBH藥理作用還有待更進一步的研究。

［1］陳德超，肖長虹，吳啟富，等.四甲基偶氮唑鹽法觀察三水白虎湯含藥血清對體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)炎滑膜細胞增殖的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11(19):3669-3672.

［2］徐曉玲，梁瑞霞，黃君健，等.細胞因子在類風濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中的作用［J］.生物技術(shù)通訊，2008，19(1):111-114.

［3］Palmer G，Mezin F，Juge-Aubry CE，et al.Interferon beta stimulates interleukin 1 receptor antagonist production in human articular chondrocytes and synovial fibroblasts［J］.Ann Rheum Dis，2004，63(1):43-49.

［4］Arend WP.The balance between IL-1 and IL-IRa in disease［J］.Cytokine Growth Factor，2002，13:323-340.

［5］肖長虹，楊敏，吳啟富，等.三水白虎湯對大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的抑制作用［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2008，(24):2288-2291.

［6］Yang M，Xiao C，Wu Q，et al.Anti-inflammatory effect of Sanshuibaihu decoction may be associated with nuclear factor-kappa B and p38 MAPK alpha in collagen-induced arthritis in rat［J］.JEthnopharmacol，2010，127(2):264-273.

［7］Matsuo K，Xiang Y，Nakamura H，et al.Identification of novel citrullinated autoantigens of synovium in rheumatoid arthritis using a proteomic approach［J］.Arthritis Res Ther，2006，8(6):R175.

［8］柏干蘋，周麗娜，賀偉峰，等.類風濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜成纖維細胞的差異蛋白質(zhì)譜分析［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2008，30(2):166-169.

［9］趙曉琴，李曉軍，趙建寧，等.雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)在類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜細胞差異蛋白分析中的應(yīng)用及意義［J］.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2010，33(7):625-630.