陳 立，鐘國強(qiáng)，涂榮會(huì)，黎慶捷，何 艷

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

縫隙連接蛋白(Cx)43是構(gòu)成哺乳動(dòng)物心肌縫隙連接通道的主要蛋白，在介導(dǎo)心肌電偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)心房或心室同步收縮、保證心臟正常節(jié)律性方面具有重要作用。研究表明，Cx43在缺血再灌注損傷及其保護(hù)作用方面具有重要的調(diào)控作用［1，2］。本課題組前期研究結(jié)果顯示，Cx43通過開放線粒體ATP敏感性鉀通道參與缺血后處理的心肌保護(hù)［3］。為進(jìn)一步探討缺血后處理的心肌保護(hù)機(jī)制，2011年3～9月，本研究成功構(gòu)建了Cx43基因RNA干擾慢病毒載體，并感染大鼠心肌細(xì)胞，以驗(yàn)證其對(duì)大鼠心肌細(xì)胞Cx43基因的作用，為后期研究Cx43基因在心肌缺血后處理的心肌保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)SD大鼠12只，雌雄不限，鼠齡1～3 d，體質(zhì)量6～8 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。293T細(xì)胞株，中國科學(xué)院細(xì)胞研究所提供;慢病毒載體系統(tǒng)(pGCL-GFP、pHelper1.0 及pHelper2.0質(zhì)粒)，上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司;限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶，NEB公司;Lipofectamine2000、Trizol，Invitrogen 公司;質(zhì)粒抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒，Qiagen公司;熒光定量PCR試劑盒，羅氏公司;兔抗鼠Cx43抗體，Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 Cx43 RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建 從GenBank中查找大鼠 Cx43 mRNA序列號(hào)(NM_012567)，根據(jù)Ambion公司軟件設(shè)計(jì)合成4對(duì)Cx43基因 shRNA序列。通過 GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析及預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終確定干擾靶序列siRNA為5'-GAAGAGAAGCTAAACAA-3'，設(shè)計(jì)合成含有酶切粘端的正向和互補(bǔ)的兩對(duì)shRNA序列，退火后得到的兩條含兩種shRNA的、約60 bp的寡核苷酸雙鏈(見表1)，與Hpa I和Xho I雙酶切pGCL-GFP載體連接、轉(zhuǎn)化，挑選陽性克隆行PCR鑒定及測序。

表1 病毒載體構(gòu)建框架

1.2.2 慢病毒包裝及滴度測定 取對(duì)數(shù)生長期293T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為 5.0×105/mL。Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋 pGCL-GFP、pHelper1.0 以及pHelper2.0載體，脂質(zhì)體 Lipofectamine2000 介導(dǎo)下感染293T細(xì)胞，培養(yǎng)8 h后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清液，過濾，4 000 g離心10 min濃縮，分裝后－80℃保存。取其中1支進(jìn)行濃度滴定，滴定方法如下:取出分裝凍存的293T細(xì)胞接種于96孔板中，每孔5.0×104個(gè)細(xì)胞，體積為100μL。24 h后將96孔板每孔吸去90μL DMEM培養(yǎng)基，加入90 μL 含病毒原液分別為 10、1、10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6μL 的病毒顆粒稀釋液。培養(yǎng) 24 h后，更換為完全培養(yǎng)基，倒置熒光顯微鏡下觀察帶綠色熒光(綠色熒光蛋白，GFP)的細(xì)胞數(shù)量。每孔GFP細(xì)胞數(shù)量除以該孔病毒原液量即為病毒滴度。

1.2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞 大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)參照 Webster等［4］方法，按 1.0 ×106/mL 接種于培養(yǎng)板中，細(xì)胞接種72 h后行病毒轉(zhuǎn)染。設(shè)空白對(duì)照(C)組、陰性對(duì)照(NC)組及基因沉默(KD)組，C組不加任何病毒原液，NC組及KD組按感染復(fù)數(shù)(MOI)值為100的病毒量分別加入NCsiRNA及KDsiRNA病毒原液。轉(zhuǎn)染72 h后觀察慢病毒GFP表達(dá)情況，熒光率大于80%者，提取細(xì)胞RNA以及總蛋白進(jìn)行檢測。

1.2.4 大鼠心肌細(xì)胞Cx43 mRNA表達(dá)檢測 采用real-time PCR法。設(shè)計(jì) Cx43上游引物:5'-TGAAAGAGAGGTGCCCAGAC-3'，下 游 引 物:5'-GCAGCCAGGTTGTTGAGTG-3';以大鼠GAPDH基因作內(nèi)參，上游引物:5'-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3'，下游引物:5'-CTCAGCACCAGCATCACC-3'。收集轉(zhuǎn)染后大鼠心肌細(xì)胞，Tirzol試劑法提取細(xì)胞總RNA，測定總RNA濃度及OD值，按Fermentas試劑盒操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性15 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)，在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析。

1.2.5 大鼠心肌細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法。抽提轉(zhuǎn)染后細(xì)胞總蛋白，行SDSPAGE電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉TBST溶液封閉1 h，兔抗鼠Cx43單克隆抗體4℃孵育過夜，洗膜，鼠抗兔IgG二抗孵育1 h，按ECL試劑盒顯色，暗室內(nèi)行膠片曝光顯影。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以ˉx±s表示，結(jié)果比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cx43基因shRNA慢病毒載體的鑒定及其滴度 Cx43基因shRNA的Oligo DNA經(jīng)退火形成三對(duì)雙鏈 DNA，經(jīng) Hpa I和 Xho I酶切、pFU-GW-siRNA載體連接、轉(zhuǎn)化后，行陽性克隆PCR鑒定，挑選陽性克隆送測序，鑒定結(jié)果與預(yù)期一致，表明合成的Cx43 shRNAOligo DNA序列插入正確。根據(jù)各孔中的熒光表達(dá)量，計(jì)算出其滴度為8×108TU/mL。

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞的效率 按MOI為100的病毒量轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞72 h后，82.59%的心肌細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。提示病毒轉(zhuǎn)染效率較高，且病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞狀態(tài)可。見圖1。

圖1 慢病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞72 h后熒光顯微鏡觀察結(jié)果(×100)

2.3 各組Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)量比較 見表1。與NC組比較，KD組Cx43 mRNA的抑制率為96.10%。使用 Gel Proanalyzer4.0分析軟件檢測Cx43蛋白條帶灰度，以 β-actin為參照，設(shè) NC組Cx43蛋白表達(dá)率為100%，計(jì)算出KD組Cx43蛋白抑制率為77.16%。

表1 各組Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)量比較(ˉx±s)

3 討論

RNA干擾現(xiàn)象最初由Fire等［5］在研究線蟲時(shí)發(fā)現(xiàn)，是利用序列特異性的、與靶基因同源的雙鏈RNA特異性地結(jié)合靶mRNA并使其降解，從而抑制靶基因表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象［6］。最初的RNA干擾實(shí)驗(yàn)采用體外合成siRNA，但費(fèi)用較高，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的siRNA半衰期短，不能持久性表達(dá)，對(duì)靶基因表達(dá)的抑制作用短暫等，從而使其應(yīng)用受到較大的限制。shRNA載體導(dǎo)入細(xì)胞后，能在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄生成shRNA，并進(jìn)一步加工生成靶基因特異性siRNA，可發(fā)揮長期抑制靶基因表達(dá)作用，但普通shRNA無法將其轉(zhuǎn)染到非分裂期細(xì)胞、原代細(xì)胞、未分化細(xì)胞等。

利用病毒載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和慢病毒等)轉(zhuǎn)染，其轉(zhuǎn)染效率高、操作簡便及shRNA在宿主細(xì)胞中能高效穩(wěn)定表達(dá)，已被廣泛用于RNA干擾的研究和治療;特別是攜帶shRNA載體的慢病毒，有著廣泛的宿主范圍，能感染分裂期與非分裂期細(xì)胞［7］，為原代細(xì)胞乃至動(dòng)物個(gè)體基因功能的研究提供了可能性，同時(shí)也使人和動(dòng)物的基因沉默治療成為可能［8，9］。其產(chǎn)生的 shRNA 靶向性好，能將外源基因有效地整合到宿主染色體上，持久性表達(dá)shRNA，有效抑制了靶基因表達(dá);產(chǎn)生的慢病毒可進(jìn)一步濃縮，從而大大提高其轉(zhuǎn)染效率［10］;此外，慢病毒本身對(duì)宿主幾乎不產(chǎn)生免疫原性，因而具有更高的安全性。基于上述特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選擇慢病毒作為載體，為今后建立離體及在體層面的靶基因抑制動(dòng)物模型提供基礎(chǔ)。

本研究成功構(gòu)建Cx43特異性RNA干擾慢病毒載體，其病毒滴度達(dá)8×108TU/mL，并成功轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞，使Cx43 mRNA表達(dá)量降低及蛋白表達(dá)量升高，為后續(xù)研究Cx43在缺血后處理中的心肌保護(hù)機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也為與心肌細(xì)胞Cx43相關(guān)的基礎(chǔ)及臨床研究提供了一個(gè)可行的研究手段。

［1］Miura T，Miki T，Yano T.Role of the gap junction in ischemic preconditioning in the heart［J］.Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2010，298(4):1115-1125.

［2］Natioh K，Yano T，Miura T，et al.Roles of Cx43-associated protein kinases in suppression of gap junction-mediated chemical coupling by ischemic preconditioning［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296(2):396-403.

［3］何燕，曾志羽，鐘國強(qiáng)，等.線粒體連接蛋白43參與缺血后處理對(duì)兔急性心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.中華心血管病雜志，2010，38(4):357-362.

［4］Webster KA，Discher DJ，Bishopcic NH.Induction and muclear accumulation of fos and jun proto-oncogenes in hypoxic cardiac myocytes［J］.J Bio Chem，1993，268(22):16852-16858.

［5］Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，1998，391(6669):806-811.

［6］Hannon GJ.RNA interference［J］.Nature，2002，418(6894):244-251.

［7］Naldini L，Blomer U，Gallay P，et al.In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector［J］.Science，1996，272(5259):263-267.

［8］Schaniel C，Lee DF，Lemischka IR.Exploration of self-renewal and pluripotency in ES cells using RNAi［J］.MethodsEnzymol，2010，477:351-365.

［9］Shimizu S，Hong P，Arumugam B，et al.A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model［J］.Blood，2010，115(8):1534-1544.

［10］Segura MM，Garnier A，Durocher Y，et al.New protocol for lentiviral vector mass production［J］.MethodsMol Biol，2010，614:39-52.