俞正霞，曲 毅，陳弘群，畢明慧，何 悅

(上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院，上海200031)

阿爾茨海默病(AD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為記憶、認(rèn)知等智能障礙，目前對其病因及發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚［1］。AD的主要神經(jīng)病理特征是在海馬組織區(qū)域出現(xiàn)淀粉樣斑塊，其斑塊的主要成分是β樣淀粉蛋白(Aβ)，Aβ在海馬區(qū)域過度沉積可引起自由基產(chǎn)生、炎癥因子分泌及神經(jīng)元損傷。大腦缺血缺氧是Aβ合成增加的誘因之一，缺氧時產(chǎn)生的缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)能啟動下游的淀粉樣前體蛋白(APP)、β-分泌酶、γ-分泌酶等基因表達(dá)，導(dǎo)致 Aβ 過度沉積，誘發(fā) AD［2，3］?？寡趸瘎┠苡行Ь徑獯竽X缺血缺氧，阻止HIF-1α產(chǎn)生，對海馬神經(jīng)元細(xì)胞起一定保護(hù)作用，減少AD發(fā)生。蝦青素是近年發(fā)現(xiàn)的、有效的抗氧化劑［4］，為探討蝦青素對海馬神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，為蝦青素臨床治療AD提供理論依據(jù)，2012年我們進(jìn)行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠10只，8日齡，體質(zhì)量(12±3)g，由中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心提供。蝦青素、Aβ25-35購自Sigma公司;PUS-2018G半自動生化儀購自普朗醫(yī)療器械公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分離及培養(yǎng) 10只大鼠用70%乙醇消毒，用剪刀剪下頭部，將無菌分離的海馬組織置入150 mL生理鹽水中;用鑷子分離海馬無關(guān)組織，用生理鹽水懸浮沉淀，仔細(xì)去除血管、筋膜及非海馬結(jié)構(gòu);然后將海馬組織置入0.125%的胰酶中消化，用彎頭吸管邊消化邊吹打，消化時間20～30 min。胰酶消化后，用含有2%B27的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液吹打均勻，24 h后換神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞。對照組在海馬神經(jīng)元細(xì)胞中加入5 mmol/L的Aβ25-35誘導(dǎo)24 h，建立AD模型;治療組在海馬神經(jīng)元細(xì)胞中分別加入蝦青素5、10、20μg/μL(蝦青素5、10、20 μg/μL 組)，然后分別加入 5 mmol/L 的Aβ25-35誘導(dǎo)24 h。

1.2.2 檢測指標(biāo) 收集海馬神經(jīng)元細(xì)胞，采用噻唑藍(lán)比色法檢測細(xì)胞存活情況;用半自動生化儀檢測細(xì)胞的抗氧化指標(biāo)超氧化物歧化酶(SOD)及脂質(zhì)過氧化物(MDA);RT-PCR法檢測細(xì)胞HIF-1α、APP、β-分泌酶、γ-分泌酶的 mRNA 表達(dá)，Western blot法檢測細(xì)胞 HIF-1α、APP、β-分泌酶、γ-分泌酶的蛋白表達(dá)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活率比較 對照組海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活率為(0.65±0.02)%，蝦青素5、10、20 μg/μL 組分別為(0.76 ± 0.03)%、(0.87 ±0.02)%、(0.97 ±0.03)%。隨著蝦青素濃度升高，海馬神經(jīng)元細(xì)胞的存活率明顯升高(P均＜0.01)。

2.2 各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞的抗氧化指標(biāo)比較 見表1。

表1 各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞的抗氧化指標(biāo)比較(ˉx±s)

2.3 各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞HIF-1α、APP、β-分泌酶、γ-分泌酶的mRNA表達(dá)比較 見表2。

2.4 各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞的 HIF-1α、APP、β-分泌酶、γ-分泌酶的蛋白表達(dá)比較 見表3。

3 討論

Aβ合成增加并沉積形成斑塊是AD發(fā)病的主要機(jī)制［2］。因此，減少Aβ合成、減少斑塊形成是防治AD的關(guān)鍵。大腦缺血缺氧時可誘導(dǎo)HIF-1α產(chǎn)生，HIF-1α 又可促進(jìn) APP、β-分泌酶、γ-分泌酶表達(dá);APP是 Aβ的前體蛋白，其可在 β-分泌酶、γ-分泌酶作用下剪切為Aβ，故HIF-1α是Aβ合成的重要誘因之一［2，3］。另外，Aβ過度沉積也可誘發(fā)自由基產(chǎn)生，對神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生毒性。因此，通過抗氧化劑治療既可通過減輕大腦的缺血缺氧狀態(tài)抑制HIF-1α表達(dá)，減少Aβ合成;又可通過提高神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)SOD活性，減少M(fèi)DA產(chǎn)生，對細(xì)胞起到保護(hù)作用。

表2 各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞的HIF-1α、APP、β-分泌酶、γ-分泌酶基因mRNA表達(dá)比較(ˉx±s)

表3 各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞HIF-1α、APP、β-分泌酶、γ-分泌酶的蛋白表達(dá)比較(ˉx±s)

蝦青素是類胡蘿卜素族成員，是蝦殼紅色色素的主要成分。近年來，有關(guān)蝦青素有抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的報道逐漸引起臨床關(guān)注［5，6］。本研究觀察了不同濃度蝦青素對大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用，檢測了其對大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞HIF-1α、APP、β-分泌酶、γ-分泌酶的基因及蛋白表達(dá)影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著蝦青素濃度升高，海馬神經(jīng)元細(xì)胞的存活率明顯升高，HIF-1α、APP、β-分泌酶、γ-分泌酶mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)明顯降低;提示蝦青素對Aβ合成具有抑制作用。蝦青素是強(qiáng)抗氧化劑，研究表明，蝦青素能明顯提高海馬神經(jīng)元細(xì)胞中的SOD表達(dá)和活性，有效清除其細(xì)胞中的MDA，從而對細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。本研究顯示，隨著蝦青素濃度升高，海馬神經(jīng)元細(xì)胞的抗氧化作用明顯升高，其中蝦青素20μg/μL組海馬神經(jīng)元細(xì)胞的SOD活性比對照組提高7倍，MDA比對照組降低5倍;說明蝦青素對海馬神經(jīng)元細(xì)胞有很好的保護(hù)作用，能有效地清除氧自由基，提高細(xì)胞的存活率和活性。

綜上所述，我們認(rèn)為蝦青素作為一種強(qiáng)抗氧化劑，在臨床治療AD上具有較好的應(yīng)用前景。

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