滕 勇，黃超洋，李小曼，謝震淵，常海艷*

(1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長沙 410081;2.上海市徐匯區(qū)斜土街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海 200030)

0 引言

巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)屬于β皰疹病毒亞科，普遍存在于自然界，具有嚴格的種屬特異性［1］。感染人的巨細胞病毒為人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)。HCMV的感染主要分為先天性感染和后天性感染［2］。孕婦在感染了 HCMV后，病毒會通過胎盤侵襲胎兒從而引起宮內(nèi)感染，受感染的胎兒會表現(xiàn)出肝脾腫大，溶血性貧血以及脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎和肝炎，嚴重的甚至可以發(fā)生流產(chǎn)和死胎;后天性感染主要有輸血感染、骨髓和異體器官移植感染、免疫功能低下感染等。目前針對HCMV感染患者的治療措施主要是服用抗病毒藥物如更昔洛韋，但是它們的治療效果很有限，難以從根本上治愈以及限制因新生兒和免疫缺陷者感染所引起的并發(fā)癥［3］。目前對于控制HCMV感染最有效的方法當(dāng)屬接種疫苗，但由于HCMV感染的復(fù)雜性，多種HCMV疫苗都處于臨床前的實驗階段［4-6］。CMV核酸疫苗的研究主要集中在IE1、pp65以及gB三個主要抗原基因。由于巨細胞病毒具有嚴格的種屬特異性，本研究選用小鼠 CMV(murine CMV，MCMV)感染小鼠作為研究對象。

IL-12是由激活的巨噬細胞、樹突狀細胞以及B細胞等抗原提呈細胞分泌產(chǎn)生的一種異源二聚體，由p35以及p40兩個亞單位組成［7］。IL-12主要引導(dǎo)免疫應(yīng)答偏向TH1型，它能刺激新產(chǎn)生的CD4+T細胞分化為TH1型細胞，增加CD8+T細胞的活性;同時IL-12還能提高NK細胞的活性，增加NK細胞分泌IFN-γ以及促進特異性殺傷T細胞的成熟等［8］。很多病原疫苗實驗證明，無論是重組IL-12蛋白還是IL-12表達質(zhì)粒都能夠增強機體對疫苗的免疫應(yīng)答［9-13］，在治療腫瘤［14］以及 HBV 感染方面也有比較好的效果［15］?？傊?，IL-12是介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的重要因子，具有內(nèi)源性佐劑的作用。

本實驗以肌肉注射輔以電擊儀的方法免疫小鼠，將MCMV IE1 DNA疫苗單獨或聯(lián)合IL-12共同免疫小鼠，評價IL-12對IE1的免疫增強效果，為巨細胞病毒核酸疫苗的研究提供實驗和理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、病毒、細胞以及實驗動物

本實驗所用IE1 DNA疫苗是將MCMV Smith株的IE1基因克隆入真核表達載體pcDNA 3.1構(gòu)建而成的重組表達質(zhì)粒，命名為pIE1。佐劑 IL-12 DNA是將鼠IL-12的p35與p40基因分別克隆入pIRES載體的多克隆位點A與多克隆位點B構(gòu)建而成的重組表達質(zhì)粒，命名為pIL-12。構(gòu)建的質(zhì)粒在大腸桿菌XL1-blue中擴增，經(jīng)質(zhì)粒大提試劑盒(MN Nucleo-Bond Xtra Maxi，Germany)提取純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

攻毒用病毒株SG-MCMV為巨細胞病毒MCMV Smith株經(jīng)小鼠唾液腺連續(xù)傳代14次增毒得到。檢測小鼠器官殘余病毒量所用的細胞為NIH-3T3細胞(ATCC CRL 1658)，培養(yǎng)時用含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)液(GIBCO)。

SPF級小鼠購自湖北省實驗動物中心，在我室SPF動物房飼養(yǎng)至6-8周齡后用于實驗。

1.2 免疫與攻毒

將6-8周齡雌性BALB/c小鼠隨機分成3組，每組 14 只。一組免疫 100 μg IE1 DNA+10 μg IL-12 DNA，一組小鼠僅免疫100 μg IE1 DNA，剩余的一組不免疫作為空白對照。共免疫2次，間隔三周。免疫采用肌肉注射輔以電擊儀的方法，免疫方法如下:酒精擦拭小鼠后腿股四頭肌，然后用一次性注射器將溶于TE的DNA疫苗(40 μL)注射入小鼠股四頭肌。在肌肉注射針孔的兩側(cè)插入電擊儀(BTX ECM-830)的兩根電極，相距0.5 cm，然后電擊(電壓100 v，電擊時間50 ms，電擊正負各三次，間隔1 s)。

二免后2周，用3倍LD50的SG-MCMV腹腔注射感染各組小鼠，注射劑量為200 μL。致死劑量的SGMCMV攻擊小鼠能夠在小鼠體內(nèi)引起劇烈的病癥反應(yīng)，未經(jīng)免疫的小鼠會在感染后3-8天內(nèi)死亡。

1.3 酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)法檢測IFN-γ

6-8周齡雌性BALB/c小鼠隨機分成3組，每組3只。按上所述進行免疫，二免后14天分離小鼠脾臟淋巴細胞。按照 Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit(DAKEWE公司)的使用說明進行操作，即適當(dāng)比例稀釋淋巴細胞后加入ELISPOT 96孔板中，用合成的4 μg/10 μL MCMV IE1 抗原表位多肽(168YPHFMPTNL176，H-2d單元型，由上海生工合成)刺激，陽性刺激物為PMA，混勻后置37℃培養(yǎng)20 h，傾倒細胞，加入冰冷去離子水使細胞完全裂解，洗去細胞殘片，加入生物素標記的抗體(ELISPTO kit，DAKEWE)100 μL/孔，37℃溫育1 h;洗板后加入酶聯(lián)親和素100 μL/孔，37℃溫育1 h;洗板后加入現(xiàn)配的AEC顯色液100 μL/孔，室溫(20-25 ℃)避光靜置 25 min，移去顯色液，揭開96孔板底座，用去離子水洗正反面及底座，將板置于室溫陰涼處，自然干后合上底座。此時可見PVDF膜上有紫色斑點，讀板得到每孔確切斑點數(shù)目，用以分析小鼠脾臟細胞分泌IFN-γ的情況，評價小鼠體內(nèi)細胞免疫水平。

1.4 小鼠器官獲取和病毒量測定

在病毒感染后的第5天，每個實驗組中隨機選取4只小鼠，氯仿麻醉后取心血處死，75%酒精浸泡20 s消毒后置于無菌操作臺取出小鼠脾臟，放入凍存管中密封，置－80℃冰箱保存待用。在病毒感染后的第21天，即觀察小鼠病癥以及體重丟失情況完成時，從每組存活的小鼠中隨機選取4只小鼠，氯仿麻醉取心血處死，75%酒精浸泡20 s消毒后置于無菌操作臺取小鼠的唾液腺，放入凍存管中密封，置－80℃超低溫冰箱保存待用。用蝕斑測定法測定器官的病毒量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

用 Student’s t-test進行評定，P ＜0.05 即為有顯著性差異。關(guān)于小鼠存活率，用Fisher’s exact test方法評定。

2 實驗結(jié)果

2.1 攻毒后小鼠的存活率、體征和體重變化

MCMV IE1 DNA疫苗單獨或者聯(lián)合IL-12 DNA共同免疫小鼠，二免后二周用3倍LD50的SG-MCMV腹腔注射感染小鼠。在攻毒后21天內(nèi)觀察小鼠的體征變化并記錄第 0、3、5、7、9、14、21 天中各組小鼠的體重丟失情況和死亡情況。如表1所示，未免疫的空白對照組小鼠在攻毒后全部死亡，疫苗單獨免疫組小鼠的存活率為40%，而聯(lián)合IL-12共同免疫之后存活率有了明顯的提高，達到了90%。

致死劑量的SG-MCMV感染小鼠后會引起明顯的感染癥狀，受病毒感染的強弱也能夠從體征表現(xiàn)出來。攻毒后第二天，不同組別的小鼠都會出現(xiàn)不同情況的聳毛、打顫、弓背、畏寒以及不活動等癥狀。空白對照與IE1單獨免疫組小鼠的癥狀相對來說比較明顯，而IL-12共同免疫組小鼠的癥狀比較輕微，在攻毒后第四天才表現(xiàn)出來。同時，如圖1所示，對照組小鼠感染后最高體重丟失率達到26%，攻毒一周內(nèi)全部死亡，IE1單獨免疫組在攻毒后第5天體重丟失率達到最大值，約20%。而聯(lián)合免疫組體重丟失率最高為10%左右，同時恢復(fù)的速度也比其它組別要快，攻毒三周之后體重超過攻毒前。

2.2 攻毒后小鼠器官的殘余病毒量

將取出的器官按重量體積比(wt/vol)1∶10勻漿，用蝕斑測定法測定器官的病毒量，各組器官病毒量測定結(jié)果見表1。

表1 免疫后小鼠抗致死量SG-MCMV攻擊的能力Tab.1 Protection against SG-MCMV challenge in mice immunized with single IE1 DNA or Il-12+IE1 DNA vaccine

致死劑量的SG-MCMV攻毒小鼠后，在急性感染期內(nèi)，小鼠的脾臟是病毒侵襲和感染的主要器官，病毒感染后4-5天，脾臟中病毒滴度達到峰值，隨后病毒下降，至第9天時無法檢測到病毒。解剖無保護率的小鼠會發(fā)現(xiàn)，經(jīng)病毒感染后，小鼠的脾臟出現(xiàn)嚴重的病變:脾臟變小，色澤發(fā)烏發(fā)黑，同時高度脂肪化等。唾液腺是病毒感染后MCMV潛伏和散播的主要器官，因此，在攻毒后21天檢測唾液腺中病毒滴度能夠很好的衡量疫苗誘導(dǎo)保護性免疫清除體內(nèi)感染病毒的能力。從表1中結(jié)果可以看出:在攻毒后5天，空白對照組的脾臟中都有很高的病毒滴度，免疫組的病毒滴度都顯著低于對照組，其中聯(lián)合IL-12共同免疫組的病毒滴度最低，顯著低于其他各組，這說明疫苗+佐劑能夠更好地保護小鼠抵抗病毒的攻擊。唾液腺病毒量是感染后21天測量的，從表中同樣可以看出，聯(lián)合免疫組感染后21天唾液腺的病毒滴度同樣是最低的。唾液腺感染病毒滴度的顯著下降是疫苗保護效果的一個很重要的指標。

2.3 細胞免疫應(yīng)答

圖2 免疫后小鼠脾臟分泌IFN-γ淋巴細胞計數(shù)Fig.2 IFN － γ secreting splenocytes in mice after immunization

小鼠經(jīng)IE1單獨或聯(lián)合IL-12免疫后，用ELISPOT的方法分析各組小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答水平。ELISPOT結(jié)果如圖2顯示，相對于空白對照組，免疫組小鼠都能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生針對IE1特異性的分泌IFN-γ的脾臟淋巴細胞，其中IE1+IL-12免疫組誘導(dǎo)產(chǎn)生的分泌IFN-γ的脾臟淋巴細胞數(shù)目比IE1單獨免疫組要高，達到了233個斑點/1×105個脾細胞。

3 討論

DNA疫苗在巨細胞病毒疫苗研究中作為新型疫苗受到研究者們的重視，但在我們以前的研究中存在免疫原性低等問題，需要多次免疫以增強免疫保護的效果。我們以前的實驗結(jié)果表明，用IE1 DNA單獨免疫小鼠，按100 μg/次的劑量免疫5次，每次間隔兩周，能夠在小鼠體內(nèi)引起較強的細胞免疫應(yīng)答，同時提供100%的保護效果。雖然達到了好的保護效果，但是免疫劑量與次數(shù)偏多，免疫周期過長。將DNA疫苗與編碼某些細胞因子的質(zhì)粒共同免疫是提高DNA疫苗免疫的策略之一。

IL-12是一種與細胞免疫應(yīng)答關(guān)系十分密切的細胞因子，在免疫應(yīng)答過程中，IL-12能刺激新產(chǎn)生的CD4+T細胞分化為TH1型細胞，增加CD8+T的活性，誘導(dǎo) IFN-γ 的產(chǎn)生等［8］。有研究報道［9-14］，將IL-12蛋白或基因混合抗原一起免疫能夠顯著提高機體特異性細胞免疫應(yīng)答水平，同時IL-12在腫瘤治療中也具有一定的效果。因此，為了增強IE1的免疫效果，本實驗選用IL-12為佐劑，將IL-12基因克隆到真核表達上，制備成分子佐劑，與IE1 DNA共同免疫，IL-12 DNA 劑量為 10 μg，免疫 2次，間隔三周。實驗結(jié)果表明，小鼠經(jīng)IE1 DNA單獨免疫2次，抗致死劑量SG-MCMV感染的保護率為40%，而加了10 μg IL-12組的保護率明顯提高，高達90%;從各組誘導(dǎo)的細胞應(yīng)答水平來看，加了 IL-12組產(chǎn)生的IFN-γ水平也更高，說明IL-12能夠提高細胞免疫應(yīng)答水平進而提高疫苗的免疫保護效果。同時還有實驗證明，使用低劑量IL-12免疫能夠增強機體的免疫應(yīng)答水平，而增加IL-12劑量之后保護率反而降低，有研究人員證明腦膜炎病毒DNA疫苗混合IL-12共同免疫后［16］，機體的特異性抗體滴度顯著降低了;IL-12混合HIV疫苗免疫同樣也降低了體液免疫應(yīng)答水平［17］;同時JEONG等證明，IL-12作為分子佐劑能夠刺激免疫應(yīng)答偏向TH1型而顯著降低機體產(chǎn)生IL-4和IL-10的水平［18］。通過本實驗，我們證明了 IL-12可以作為巨細胞病毒IE1 DNA疫苗的佐劑，能夠從提高機體細胞免疫應(yīng)答方面來增強疫苗的免疫效果，提高對機體的抗病毒感染保護率。這個結(jié)果為以后巨細胞病毒DNA疫苗的研究提供了有用的參考。

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