殷玉琨，宋愛莉，孫子淵

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟南250014;2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

乳腺癌的發(fā)病率居女性惡性腫瘤的首位，且不斷上升，并有年輕化趨勢，嚴重危害婦女健康。雖然近年來其治療已取得長足進展，但一些惡性程度較高的類型及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的晚期患者預(yù)后較差。其中三陰性乳腺癌發(fā)病率約占乳腺癌所有類型發(fā)病率的17．27%［1］，且由于其生物學(xué)特性，對內(nèi)分泌治療不敏感［2］。尋找有效的治療藥物是目前研究的熱點之一。欖香烯乳系中藥莪術(shù)提取物，是我國具有獨立產(chǎn)權(quán)的抗癌新藥，對肺癌、肝癌、食管癌、鼻咽癌和婦科腫瘤等多種惡性腫瘤的體內(nèi)、外增殖具有抑制作用［3，4］，并可以增強臨床多種抗癌藥物的療效，降低放化療的毒副反應(yīng)［5，6］;臨床上主要用于介入、腔內(nèi)化療及癌性胸腹水的治療［7，8］，具有良好的應(yīng)用前景。但目前關(guān)于欖香烯乳作用于乳腺癌的效果及機制的研究較少。我們既往研究表明，莪術(shù)油(其主要抗腫瘤成分為欖香烯乳)可以降低乳腺癌及癌前病變造模大鼠成瘤率、腫瘤組織血管生成，促進腫瘤細胞凋亡等［9，10］。2012年7 月 ～2013 年 1 月，我們在既往研究的基礎(chǔ)上，觀察欖香烯乳對乳腺癌細胞株生長及凋亡的影響，以探索欖香烯乳抗乳腺癌的機制。

1 材料與方法

1．1 材料 選用 ER、PR、HER-2均陰性的高侵襲乳腺癌細胞系MDA-MB-231及ER陽性、PR陽性、HER-2陰性的低侵襲乳腺癌細胞系MCF-7(英國卡迪夫大學(xué)外科系實驗室惠贈)。欖香烯乳注射液(100 mg/20 mL)購自大連華立金港藥業(yè)有限公司(批號:1207161)，胎牛血清和DMEM/Ham's F12購自PAA Laboratories公司，Tri-reagent試劑、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及GAPDH 的Q-PCR引物均購自Sigma公司。

1．2 方法

1．2．1 MDA-MB-231及MCF-7細胞系的培養(yǎng) 用含10%胎牛血清和DMEM/Ham's F12培養(yǎng)液在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，選用對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1．2．2 結(jié)晶紫法檢測細胞生長速率［11］將對數(shù)生長期的MDA-MB-231及MCF-7細胞接種于96孔板，每孔種2 000個細胞(200μL)，每組重復(fù)5孔，重復(fù)3板，分別標記“0 h”、“48 h”和“96 h”。分別設(shè)空白對照組，及不同濃度的欖香烯乳處理組?？瞻讓φ战M加入欖香烯乳的普通培養(yǎng)基，欖香烯乳處理組分別加入終濃度含10、20、40、80、160 μg/mL 的欖香烯乳注射液的培養(yǎng)基。放入孵育箱培養(yǎng)(37℃、5%CO2、飽和濕度)，于種植后第 1 天(0 h)、第3天(48 h)、第4天(96 h)分別取出，去掉培養(yǎng)液，加入4%甲醛固定過夜，0．5%結(jié)晶紫染色10 min后沖洗晾干，10%醋酸溶液溶解后，置于540 nm分光光度計(BIO-TEK，ELx800)讀取吸光值(OD值)。細胞生長速率表示為(OD48h或 OD96h－OD0h)/OD0h×100%。細胞抑制率表示為(1－OD處理組/OD對照組)×100%。實驗重復(fù)3次。應(yīng)用藥物濃度計算軟件(LOGIT法)計算中位抑制濃度(IC50)。

1．2．3 RNA提取及cDNA逆轉(zhuǎn)錄［12］標記培養(yǎng)瓶MDA-MB-231或 MCF-7空白對照、欖香烯乳處理組，分別種植對數(shù)生長期的細胞1×106于培養(yǎng)瓶中，加入普通培養(yǎng)基孵育過夜(37℃、5%CO2、飽和濕度)。待細胞貼壁后，分別換入新鮮普通培養(yǎng)基或含40μg/mL欖香烯乳的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，顯微鏡下拍照記錄細胞形態(tài)。Tri-reagent試劑提取細胞RNA，質(zhì)量檢測后，逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。

1．2．4 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 檢測 采用Q-PCR法［13］。分別取欖香烯乳處理后的及空白對照的MDA-MB-231細胞的cDNA，分別制備Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 及 GAPDH 的 Q-PCR 反應(yīng)液，應(yīng)用 Icycler IQ5 system(Bio-Rad，Hammel Hemstead，UK)Real-time PCR系統(tǒng)獲取不同組間的Caspase及內(nèi)參GAPDH的表達值。引物序列如下:Caspase-3正向引物為5'-GGCGTGTCATAAAATACCAG-3'，反向引物為5'-ACTGAACCTGACCGTACAACAAAGCGACTGGATGAA-3';Caspase-8正向引物為5'-AGAAAGGAGGAGATGGAAAG-3'，反 向 引 物 為5'-ACTGAACCTGACCGTACAGACCTCAATTCTGATCTGCT-3';Caspase-9正向引物為5'-AAGCCCAAGCTCTTTTTC-3'，反向引物為5'-ACTGAACCTGACCGTACAGTTACTGCCAGGGGACTC-3';GAPDH正向引物為5'-CTGAGTACGTCGTGGAGTC-3'，反向引物為5'-ACTGAACCTGACCGTACACAGAGATGACCCTTTG-3'。反應(yīng)條件如下:95℃15 min預(yù)變性，然后按95 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s(共60個循環(huán))，最后72℃10 min延伸。反應(yīng)結(jié)束后確認Real-time PCR的擴增曲線和融解曲線，并對結(jié)果進行分析:相對定量=目的基因的表達×內(nèi)參基因表達的修正比值。

1．2．5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件。所有實驗均重復(fù)3次以上，實驗結(jié)果采用ˉx±s表示，計量資料的組間比較采用t檢驗。P≤0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 欖香烯乳對細胞生長速率的影響 分別用不同終濃度的欖香烯乳處理細胞48、96 h后，與對照組(0μg/mL)比較，欖香烯乳濃度達到一定劑量時，細胞的生長速率明顯下降，且呈時間—劑量依賴性。48 h時對MDA-MB-231細胞的IC50為58μg/mL，對MCF-7細胞的IC50為148μg/mL。見表1。

2．2 欖香烯乳對細胞形態(tài)的影響 終濃度為40 μg/mL的欖香烯乳培養(yǎng)基處理 MDA-MB-231和MCF-7細胞48 h后，與對照組比較，應(yīng)用欖香烯乳的細胞由黏附狀態(tài)變圓，細胞核固縮、崩解，可見凋亡小體，呈現(xiàn)典型的細胞凋亡表現(xiàn)。見插頁Ⅰ圖1。2．3 欖香烯乳對MDA-MB-231細胞Caspase表達的影響 空白對照組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 表達量(×107拷貝量)分別為56．7 ±15．7、140．3±25．6、13．1 ±4．4，經(jīng)欖香烯乳處理后分別為812．2±222．6、327．8 ±50．1、5．7 ±1．5，與空白對照組比較，經(jīng)欖香烯乳處理后Caspase-3、Caspase-8表達量升高(P均＜0．05)，Caspase-9表達量無明顯變化(P＞0．05)。

表1 欖香烯乳對細胞生長速率的影響(%±s)

表1 欖香烯乳對細胞生長速率的影響(%±s)

注:與0 μg/mL 比較，*P ＜0．05，△P ＜0．01

欖香烯乳MDA-MB-231 MCF-7 48 h 96 h 0μ 48 h 96 h g/mL 252±13 641±11 404±50 1 022±111 10μg/mL 271± 9 624±29 451±64 1 178±100 20μg/mL 254± 9 540±29* 435±54 1 200± 96 40μg/mL 214±15 557±17△ 400±33 1 074± 51 80μg/mL 48±12△ 160±27△ 326±41 897± 69 160μg/mL －25± 5△ －45± 6△ 181±34* 277±137△

3 討論

乳腺癌是臨床常見的惡性腫瘤，目前以手術(shù)、化療、放療的綜合治療為主，但仍有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的治療失敗者，尤其三陰性乳腺癌對內(nèi)分泌治療不敏感，且目前缺乏相應(yīng)的靶向治療藥物。欖香烯乳作為Ⅱ類非細胞毒性抗腫瘤藥，具有化療增敏、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥和提高機體免疫功能等多重作用，且不良反應(yīng)較輕，因而在乳腺癌的臨床治療上有良好的應(yīng)用前景。經(jīng)文獻檢索，既往已進行了欖香烯乳對多種惡性腫瘤的體內(nèi)及體外實驗，但針對欖香烯乳治療三陰性乳腺癌的效果及機制的報道較少。

既往研究證明，欖香烯乳可抑制多種腫瘤細胞的生長，誘導(dǎo)其凋亡是其主要的途徑之一。本研究選擇ER陽性、PR陽性、Her-2陰性的低侵襲性細胞株MCF-7及ER、PR、Her-2均陰性的高侵襲性細胞株MDA-MB-231，采用欖香烯乳進行干預(yù)觀察其對MDA-MB-231細胞生長速率及凋亡誘導(dǎo)的影響。實驗結(jié)果表明，當欖香烯乳達到一定濃度時，可抑制乳腺癌細胞的生長，且呈濃度依賴性;相對于低侵襲性的MCF-7細胞系，對高侵襲性MDA-MB-231細胞系的抑制作用更為明顯;經(jīng)過欖香烯乳處理后，兩種細胞系均呈現(xiàn)出細胞凋亡的形態(tài)特征;針對欖香烯乳作用后的MDA-MB-231細胞凋亡因子的檢測顯示，欖香烯乳可能是通過誘導(dǎo)了乳腺癌細胞的凋亡從而達到抑制其生長的作用。

細胞凋亡亦稱程序性細胞死亡，是一種受遺傳學(xué)機制調(diào)控的為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的細胞自殺過程?，F(xiàn)代腫瘤學(xué)認為，逃避免疫監(jiān)視是腫瘤發(fā)生與發(fā)展的重要機制之一。隨著對腫瘤細胞凋亡研究的深入，科研人員發(fā)現(xiàn)細胞凋亡在腫瘤免疫逃逸中起著重要作用。越來越多的實驗證實，Caspases在細胞凋亡調(diào)節(jié)過程中起關(guān)鍵作用［14］。細胞凋亡受到嚴格調(diào)控，在正常細胞Caspase處于非活化的酶原狀態(tài)，凋亡程序一旦開始，Caspase被激活，隨后凋亡蛋白酶的層疊級聯(lián)反應(yīng)以不可逆的形式發(fā)生。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn) Caspase家族至少有14個成員，其中Caspase-2、8、9、10、11 主要負責(zé)對執(zhí)行者的前體進行切割，從而產(chǎn)生有活性的執(zhí)行者;Caspase-3、6、7主要負責(zé)切割細胞核內(nèi)、細胞質(zhì)中的結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白。細胞凋亡的途徑有死亡受體路徑、線粒體路徑等。在死亡受體路徑中，Caspase-2、8被激活，最終激活其效應(yīng)器酶(通常Caspase-3)而導(dǎo)致細胞死亡［15］;在線粒體路徑中，Caspase-9被激活，然后激活下游的效應(yīng) Caspase 如 Caspase-2、3、6、7、8、10，啟動Caspase的級聯(lián)反應(yīng)，引起細胞凋亡［16］。本研究中，經(jīng)欖香烯乳處理后的 MDA-MB-231細胞Caspase-3、Caspase-8上調(diào)，而Caspase-9與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，提示欖香烯乳誘導(dǎo)的乳腺癌細胞凋亡，可能是通過死亡受體路徑引起的。

綜上所述，欖香烯乳抑制乳腺癌細胞的生長速率，其可能機制是通過激活死亡受體途徑誘導(dǎo)了細胞的凋亡。本次實驗結(jié)果為后續(xù)研究提供了良好的前期基礎(chǔ)，同時也為臨床選擇三陰性乳腺癌治療方案提供了一些思路及實驗支持。

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