朱廣軍，張莉，郭敏

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001;2.盤錦市第二人民醫(yī)院，遼寧 盤錦 124000)

神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic Pain，NPP)是繼發(fā)于外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的一種慢性疾病狀態(tài)，以痛覺的高反應(yīng)性如痛覺過敏、痛覺超敏、感覺缺失及自發(fā)疼痛等為主要臨床病理生理學(xué)特點［1－3］。隨著社會老齡化，該疾病的發(fā)病率逐年增高，嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量。因此，深入研究NPP 的發(fā)病機制從而探索有效的治療措施已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)研究的熱點之一。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，鋅離子可能參與了NPP 的產(chǎn)生與維持，因此，為了深入研究鋅參與NPP 的可能機制，本研究擬應(yīng)用金屬自顯影技術(shù)，原子吸收光譜技術(shù)和圖像分析技術(shù)檢測辣椒素致痛模型小鼠脊髓后角鋅的分布變化，并且檢測鋅預(yù)處理對辣椒素致痛模型小鼠脊髓后角鋅分布的影響，從而為深入研究鋅參與NPP發(fā)病機制提供基礎(chǔ)的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型制備

8 周齡C57/BL6 小鼠48 只，雌雄各半，體重30～40 g，隨機分為4 組: (1)對照組(Con):正常喂養(yǎng)(鋅:30.0 mg/kg)2 w 后足底注射生理鹽水;(2)N－CAP 組:正常喂養(yǎng)(鋅:30.0 mg/kg)2 w 后足底注射辣椒素 (0.5%，5 μL);(3)L－CAP組:低鋅喂養(yǎng)(鋅:0.85 mg/kg)2 w后足底注射辣椒素(0.5%，5 μL);(4)H－CAP組:高鋅喂養(yǎng)(飲用硫酸鋅水溶液，227 mg/L)2 w 后足底注射辣椒素(0.5%，5 μL)。

1.2 原子吸收光譜技術(shù)

術(shù)后7 d，各組小鼠麻醉后取新鮮的腰5 節(jié)段脊髓組織，微波熱能消化脊髓組織，3000 r/min離心10 min 后取上清液，進(jìn)行原子吸收光譜檢測。

1.3 金屬自顯影技術(shù)

小鼠腹腔注射硒酸鈉(20 mg/kg)，存活1.5 h后將動物麻醉，2.5%的戊二醛經(jīng)心臟灌流固定，取腰5 節(jié)段脊髓。后固定3 h，30%蔗糖4 ℃過夜，恒冷切片機制備10 μm 冰凍切片。切片置于孵育液(60 mL 阿拉伯膠、10 mL 檸檬酸緩沖液、15 mL對二苯酚和15 mL 乳化銀)，26 ℃孵育60 min。常規(guī)脫水、透明和封片，光鏡下觀察。

1.4 圖像分析與統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 原子吸收光譜檢測結(jié)果

原子吸收光譜檢測結(jié)果顯示，與對照組(Con組)比較，NPP 小鼠脊髓的鋅含量均顯著減少(P＜0.01)，高鋅預(yù)處理(H－NPP 組)能提高脊髓的鋅含量(P ＜0.01)，低鋅預(yù)處理(H－NPP 組)則加重脊髓的缺鋅狀態(tài)(P ＜0.01)(圖1)。

2.2 金屬自顯影技術(shù)染色結(jié)果

金屬自顯影染色陽性反應(yīng)產(chǎn)物為棕黑色顆粒狀。與對照組(Con 組)相比，H－CAP 組脊髓背側(cè)角淺層的鋅離子顯著增多(P ＜0.01);而N－CAP 組和L－CAP 組脊髓背側(cè)角淺層的鋅離子均顯著減少(P ＜0.01)。其中，L－CAP 組脊髓背側(cè)角淺層的鋅離子顯著低于N－ CAP 組(P ＜0.01)(圖2)。

2.3 圖像分析結(jié)果

圖像分析顯示，與對照組(Con 組)比較，H－CAP 組的吸光度值顯著降低(P ﹤0.01)，N－CAP 組和L－ CAP 組的吸光度值顯著增加(P ﹤0.01)，其中L－ CAP 組的吸光度值最高(P ﹤0.01)(圖3)。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，NPP 的發(fā)病機制復(fù)雜，發(fā)病原因多樣，近年來由于癌癥等疾病的生存率提高，因此導(dǎo)致NPP 的發(fā)病率顯著增加，高達(dá)1%［4－5］。NPP 通常呈慢性，可持續(xù)數(shù)周、數(shù)月甚至數(shù)年，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。由于NPP 的臨床治療目前仍缺乏有效措施，因此，仍需深入探討NPP 的發(fā)病機制，從而為尋找NPP 治療的有效方法而提供基礎(chǔ)的實驗依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，鋅是機體重要的微量元素，它廣泛分布于各種組織和器官中［6］，在大腦、小腦、脊髓、背根神經(jīng)節(jié)和頸上神經(jīng)節(jié)等神經(jīng)系統(tǒng)中的分布尤其豐富［7－8］。這些鋅離子主要分布于神經(jīng)元胞體的核周質(zhì)中或者是軸突終末的突觸小泡內(nèi)，參與蛋白質(zhì)的合成或者伴隨神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)的釋放，從而可在神經(jīng)活動中發(fā)揮著重要的作用。近年來的實驗研究表明，鋅可能與NPP 的產(chǎn)生與傳遞有著密不可分的關(guān)系。有研究［9－10］發(fā)現(xiàn)，鋅離子能影響非NMDA 受體的表達(dá)與功能，而這個受體在傷害性刺激傳導(dǎo)過程中起著非常重要的作用。Jo等［11］將動物的脊神經(jīng)背根切斷，用金屬自顯影技術(shù)發(fā)現(xiàn)在脊髓背側(cè)角的淺層，鋅離子的分布顯著減少，同時伴隨小鼠機械痛閾值的降低，小鼠出現(xiàn)痛覺過敏現(xiàn)象，推斷鋅可能參與了痛覺的傳導(dǎo)。本研究中利用原子吸收光譜技術(shù)和金屬自顯影技術(shù)也發(fā)現(xiàn)，足底注射辣椒素后，小鼠脊髓組織中的鋅顯著減少，脊髓后角淺層的AMG 陽性顆粒顯著減少，分析可能是由于辣椒素致痛時，大量鋅離子伴隨著神經(jīng)遞質(zhì)在脊髓后角淺層釋放，從而造成鋅耗竭。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，缺鋅可以使NPP 模型動物的機械性痛閾值降低，動物出現(xiàn)痛覺過敏和痛覺超敏現(xiàn)象，提示NPP 時引起的脊髓后角淺層缺鋅可能是導(dǎo)致異常痛的原因。那么給予鋅預(yù)處理是否能改變脊髓后角中的鋅的分布呢?本實驗給予動物高鋅或低鋅預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)給予高鋅預(yù)處理時，NPP 模型動物脊髓中的鋅含量增高;而給予低鋅預(yù)處理時，NPP 模型動物脊髓中的鋅含量降低，提示鋅預(yù)處理能影響NPP 模型動物脊髓鋅的分布。

本研究利用原子吸收光譜、金屬自顯影技術(shù)和圖像分析技術(shù)觀察了鋅預(yù)處理對辣椒素致痛模型小鼠脊髓后角淺層鋅離子分布的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)足底注射辣椒素后，脊髓后角淺層的鋅離子顯著減少，提示鋅與NPP 的產(chǎn)生與傳導(dǎo)密切相關(guān);此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)鋅預(yù)處理可以改變鋅離子在NPP 動物脊髓后角淺層的分布。本實驗有望為進(jìn)一步研究鋅參與NPP 的形成機制提供基礎(chǔ)的實驗依據(jù)。

圖1 各組小鼠脊髓鋅的含量(mg/kg，，n=6)

圖2 金屬自顯影染色顯示鋅在各組模型動物脊髓的分布

圖3 各組小鼠脊髓的吸光度值(金屬自顯影染色圖像分析，，n=6)

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