李娜，張莉，郭敏

(遼寧醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001)

神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic Pain，NPP)是由于感染、外傷、腫瘤等原因?qū)е碌纳窠?jīng)系統(tǒng)損傷后的一種慢性疾病狀態(tài)，其主要的臨床病理生理學(xué)特點是痛覺過敏、痛覺超敏、感覺缺失及自發(fā)疼痛等［1－3］。近年來，NPP 的發(fā)病率逐年增高，由于缺乏有效的治療手段，因此已經(jīng)嚴重影響了患者的生存質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，脊髓后角神經(jīng)細胞凋亡是NPP發(fā)病的重要機制之一［4］，而微量元素鋅可能參與了NPP 的形成與傳導(dǎo)［5］，因此，為了深入研究鋅參與NPP 的可能機制，本研究擬應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫印跡技術(shù)和圖像分析技術(shù)檢測鋅預(yù)處理對辣椒素致痛模型小鼠脊髓后角caspase－9 的表達的影響，從而為深入研究鋅參與NPP 的發(fā)病機制提供基礎(chǔ)的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型制備

8 周齡C57/BL6 小鼠48 只，雌雄各半，體重30～40 g，隨機分為4 組:(1)對照組(Con):正常喂養(yǎng)(鋅:30.0 mg/kg)2 w 后足底注射生理鹽水;(2)N－CAP 組:正常喂養(yǎng)(鋅:30.0 mg/kg)2 w后足底注射辣椒素(0.5%，5 μL); (3)L－CAP組:低鋅喂養(yǎng)(鋅:0.85 mg/kg)2 w 后足底注射辣椒素(0.5%，5 μL); (4)H－CAP 組:高鋅喂養(yǎng)(飲用硫酸鋅水溶液，227 mg/L)2 w 后足底注射辣椒素(0.5%，5 μL)。

1.2 取材與標本制備

足底注射辣椒素后7 d，取小鼠腰5 節(jié)段脊髓，一部分用于免疫印跡檢測，一部分經(jīng)4%多聚甲醛固定12 h 后制備5 μm 厚的石蠟切片備用。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，微波修復(fù)。0.01 M PBS 沖洗5 min ×3 次;滴加3%H2O2室溫10 min;PBS 沖洗5 min×3 次;滴加正常非免疫動物血清，常溫10 min;滴加兔抗小鼠多克隆caspase－9 抗體(1∶100)，4 °C 過夜;PBS 沖洗5 min×3 次;山羊抗兔IgG (1∶200)，室溫孵育10 min;PBS 沖洗5 min×3 次;鏈霉素抗生物素—過氧化物酶室溫孵育10 min;PBS 沖洗5 min×3 次;DAB 顯色3～10 min，蘇木精復(fù)染細胞核，常規(guī)脫水、透明、封片，光鏡下觀察。用正常非免疫動物血清代替一抗作為陰性對照。

1.4 免疫印跡檢測

脊髓稱重后按1∶5 的比例加入0.9%NaCl 溶液，于冰上剪碎樣品，4 ℃低溫離心，棄上清，按1∶5 比例加入蛋白裂解液，超聲粉碎，4 ℃裂解過夜，4 ℃低溫離心30 min，取上清，考馬斯亮藍法進行蛋白定量。樣品水浴煮沸5 min 后進行10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電壓為90 V，分離膠轉(zhuǎn)為110 V。轉(zhuǎn)膜、3%牛血清封閉3 h 后加入一抗稀釋液(兔抗小鼠多克隆抗體，caspase－91∶200)4 ℃過夜，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶5000)室溫下孵育2 h。用ECL 發(fā)光試劑盒顯像。

1.5 圖像分析與統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

Caspase－9 免疫組織化學(xué)陽性反應(yīng)產(chǎn)物為棕褐色顆粒狀，主要表達在小鼠脊髓后角淺層神經(jīng)元的細胞質(zhì)中。其中，對照組(Con 組)脊髓后角有少量Caspase－9 陽性反應(yīng)產(chǎn)物。與Con 組相比較，其它3 組模型動物脊髓后角淺層的陽性反應(yīng)產(chǎn)物均顯著增多;其中，L－CAP 組的陽性反應(yīng)產(chǎn)物最密集;H－CAP 組的陽性反應(yīng)產(chǎn)物最稀疏(圖1)。

2.2 圖像分析結(jié)果

圖像分析顯示，與對照組(Con 組)比較，其它三組的光密度值顯著增高(P ﹤0.01)，其中，L－CAP 組的光密度值最高(P ﹤0.01)，H－CAP組的光密度值最低(P ﹤0.01)(圖2)。

2.3 免疫印跡結(jié)果

經(jīng)免疫印跡顯影后，可確認有Caspase－9 蛋白條帶。圖像分析顯示:與對照組(Con 組)相比較，其它三組的Caspase－9 蛋白表達均顯著增高(P ﹤0.01)。其中，L－CAP 組的表達最高，H－CAP 組的表達最低(P ﹤0.01)(圖3)。

3 討 論

神經(jīng)病理性疼痛是由中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷而引起的不愉快感覺和情緒體驗，即通常所指的慢性疼痛。創(chuàng)傷、代謝性疾病、腫瘤化療、手術(shù)、射線、神經(jīng)毒性藥物、神經(jīng)受壓缺血、炎癥和腫瘤的侵襲都可引起神經(jīng)性疼痛［6］。它與急性疼痛不同，表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛(針刺、電灼、撕裂、刀割樣疼痛)和誘發(fā)性疼痛(即感覺異常和痛覺過敏)，可以持續(xù)存在，對機體無益，甚至?xí)乐赜绊懮钯|(zhì)量。

研究發(fā)現(xiàn)，NPP 的發(fā)病機制復(fù)雜，分為中樞機制與外周機制。其中，神經(jīng)損傷可引起PKC 激活，后者促使轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白激活，調(diào)節(jié)即刻早期基因c－fos 和c－Jun 的轉(zhuǎn)錄和表達，從而激活其下游的c－Jun 激酶，引起脊髓表層神經(jīng)元和中間抑制性神經(jīng)元的凋亡，這也是脊髓敏化形成的重要因素。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族(caspase)是細胞凋亡的分子機制中重要的效應(yīng)因子，其中caspase－ 9 作為起始caspase，它能感受上游凋亡信號，引起下游caspase 活化，參與由細胞色素－C 激活的內(nèi)源性細胞凋亡途徑，從而最終激活下游的效應(yīng)因子caspase－3、7，使細胞骨架蛋白和細胞修復(fù)酶等靶蛋白裂解，發(fā)生細胞凋亡［7］。傅［4］25－28等發(fā)現(xiàn)，大鼠足底皮下注射福爾馬林能導(dǎo)致脊髓后角神經(jīng)元凋亡。胡［8］等發(fā)現(xiàn)，慢性坐骨神經(jīng)壓迫性損傷可以引起大鼠脊髓后角凋亡神經(jīng)元數(shù)量顯著增多。本研究結(jié)果與上述結(jié)果相符，足底注射辣椒素后，小鼠脊髓后角淺層caspase－9 的表達顯著增高，光密度值增多;免疫印跡分析也顯示caspase－9 蛋白表達增多。

近年來的研究顯示，微量元素鋅可能與NPP的產(chǎn)生與傳遞有著密不可分的關(guān)系。據(jù)相關(guān)報導(dǎo)［9－10］，鋅離子能影響非NMDA 受體的表達與功能，而這個受體在傷害性刺激傳導(dǎo)過程中起著非常重要的作用。Jo 等［11］將動物的脊神經(jīng)背根切斷，用金屬自顯影技術(shù)發(fā)現(xiàn)在脊髓背側(cè)角的淺層，鋅離子的分布顯著減少，同時伴隨小鼠機械痛閾值的降低，小鼠出現(xiàn)痛覺過敏現(xiàn)象，推斷鋅可能參與了痛覺的傳導(dǎo)。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫印跡技術(shù)和圖像分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)，高鋅預(yù)處理可以使辣椒素致痛模型小鼠脊髓后角淺層的caspase－9 蛋白表達減少，光密度值降低;而低鋅預(yù)處理能使caspase－9 的表達增多，光密度值增高，提示鋅能抑制NPP 模型動物脊髓后角神經(jīng)元凋亡。

本研究利用免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫印跡技術(shù)和圖像分析技術(shù)分析了鋅預(yù)處理對辣椒素致痛模型小鼠脊髓后角淺層caspase－9 蛋白表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)足底注射辣椒素后，脊髓后角淺層caspase－9 的表達顯著增多，高鋅預(yù)處理使caspase－9 的表達上調(diào)，低鋅預(yù)處理使蛋白表達下調(diào)，提示鋅可能抑制了模型動物脊髓后角caspase－9 的表達，從而抑制了神經(jīng)元的凋亡，但是其具體的抑制機制還需要進行深入的研究。

圖1 免疫組織化學(xué)染色顯示caspase－9 在各組模型動物脊髓的分布，×400

圖2 各組小鼠脊髓的光密度值(caspase－9 免疫組化染色圖像分析，，n=6)

圖3 免疫印跡檢測caspase－9 在各組小鼠脊髓的表達(，n=6)

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