岳凌菊

(北京市通州區(qū)潞河醫(yī)院腎病內(nèi)科，北京 101149)

以往的研究發(fā)現(xiàn)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)可以調(diào)節(jié)腎臟系膜細(xì)胞(mesangial cell，MsC)生長并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellul matrix，ECM)的代謝，能引起腎小球炎癥、腎臟纖維化和硬化病變［1］。多項(xiàng)研究報(bào)道表明，山梨醇脫氫酶(sorbitol dehydrogenase，SDH)為多元醇通路(polyol pathway)中的一個酶，參與腎小球炎癥、腎臟纖維化和硬化的發(fā)生、發(fā)展，特別是在糖尿病腎病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用［2］。為此，本實(shí)驗(yàn)采用體外施加外源性bFGF 對培養(yǎng)的大鼠MsC 中SDH 表達(dá)的影響，并同時應(yīng)用抗血清制作大鼠抗Thy－1 腎炎模型［3］，應(yīng)用這個動物模型在體探討bFGF、SDH 的表達(dá)以及二者之間的相互關(guān)系，為深入探索bFGF 和SDH在腎小球硬化發(fā)生機(jī)制中的作用及其相互關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 大鼠系膜細(xì)胞(MsC)培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)動物為150～180 g SD 大鼠(SPF 級，購自中科院)，取腎皮質(zhì)，分離腎小球，按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法在無菌條件下分離培養(yǎng)與鑒定MsC。MsC 生長至亞匯合狀態(tài)后，用0.25% 胰蛋白酶 (含0.01EDTA)消化并傳代，將其(1 ×106)接種于6 cm 培養(yǎng)皿中，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選用傳6～9代的細(xì)胞。

1.2 MsC 的處理

待MSC 生長至80%匯合時，應(yīng)用饑餓法處理細(xì)胞24 h，即完全培養(yǎng)基更換為RPMI1640 (含0.5% FBS)培養(yǎng)液，然后向0.05%FBS 的RPM 1640 培養(yǎng)基中加入人重組bFGF 處理，使其終濃度達(dá)到2 ng/mL，選擇0、12、24 h，收集細(xì)胞提取總蛋白和總RNA。另一組向培養(yǎng)基中加入人重組bFGF 處理，使其終濃度達(dá)到0、2、5 ng/mL，處理24 h 后，收集細(xì)胞并提取總蛋白和總RNA。

1.3 大鼠抗Thy－1 模型制作

選擇雄性SD 大鼠(SPF 級，150～200 g，購自中科院)36 只，實(shí)驗(yàn)分組情況如下:對照組(N 組，n=6)、腎炎組(G 組，于尾靜脈注射兔抗鼠Thy1 血清，分別于注射后1、3、5、7、14 天處死動物，其中14 d 組在第7 天加強(qiáng)1 次，每個時間點(diǎn)各6 只動物)［3］241－243。動物處死后，分離腎皮質(zhì)并提取總蛋白備用。

1.4 Western blot 檢測bFGF、SDH 蛋白

取1.2、1.3 方法中提取的總蛋白各20 mg，按照試劑盒說明應(yīng)用Western blot 方法檢測bFGF、SDH 的蛋白檢測。一抗為小鼠抗人SDH 單克隆抗體(1 ∶500，Santa Cruz 公司)和兔抗人bFGF 多克隆抗體(1 ∶200，Santa Cruz 公司)。

1.5 RT－qPCR 檢測SDH mRNA

分別取MsC bFGF 刺激后不同時間段、不同濃度bFGF 刺激后的總RNA 2 mg 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。等量cDNA 進(jìn)行 qPCR 反應(yīng)，引物如下:SDH(sense:TTAGAGGAGCTGGCGTGCCTTAAA;antisense TGCTTCGTCT CCTCACCCAAAGAA);GAPDH (sense: CCACAG TCCATGCCATCAC; antisense:CCACCACCCTGTTG CTGTAG)。采用ABI公司7900 實(shí)時定量PCR 儀進(jìn)行qPCR 試驗(yàn)，采用Sybergreen 染料摻入法，并計(jì)算相對濃度。

2 結(jié) 果

2.1 MsC 的培養(yǎng)

腎小球在原代培養(yǎng)的72 h 后開始貼壁，在96 h 左右開始有細(xì)胞從腎小球的周圍爬出，1 w 時可見爬出的細(xì)胞明顯增多。最初的細(xì)胞呈長圓形，偶可見有突起的細(xì)胞，后逐漸呈長梭形，類似成纖維細(xì)胞，偶可見細(xì)胞呈類神經(jīng)元的形態(tài)。2 w 時，可見細(xì)胞達(dá)到85%左右的融合。常規(guī)傳代培養(yǎng)后，其生長狀態(tài)與間充質(zhì)干細(xì)胞的狀態(tài)相似，12 h 開始貼壁，并且細(xì)胞生長迅速，大約在5 d 左右細(xì)胞可以進(jìn)行下一次傳代。

2.2 bFGF 作用后大鼠系膜細(xì)胞SDH mRNA 的表達(dá)

SDH mRNA 在2 ng/mL bFGF 刺激后，其表達(dá)開始升高，在24 h 達(dá)到高峰;同樣，在不同濃度bFGF 作用后，SDH mRNA 也表達(dá)升高，在5 ng/mL 達(dá)到高峰(圖1)，顯示了時間劑量依賴性。

2.3 bFGF 作用后大鼠系膜細(xì)胞SDH 蛋白的表達(dá)

SDH 蛋白在bFGF 作用后表達(dá)升高，在24 h達(dá)到高峰;同樣，在不同濃度bFGF 作用后，SDH蛋白也表達(dá)升高，在5 ng/mL 達(dá)到高峰，其趨勢與核酸水平的變化吻合(圖2)，同樣顯示了時間劑量依賴性。

2.4 ATG 大鼠腎皮質(zhì)bFGF、SDH 的表達(dá)

Western blot 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在制作大鼠抗Thy－1 模型實(shí)驗(yàn)過程中，bFGF 表達(dá)量從注射后第3天起開始逐漸升高，到第7 小時達(dá)到高峰，一直維持在此水平，直到第14 天。SDH mRNA 的表達(dá)從實(shí)驗(yàn)第3 天起開始持續(xù)升高，至14 d 達(dá)到高峰(圖3)。

3 討 論

大量研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積是腎小球硬化發(fā)生和發(fā)生的重要病理過程之一，腎小球內(nèi)功能活躍的固有細(xì)胞—系膜細(xì)胞和bFGF 在這一過程中起著重要作用，但其確切作用機(jī)制的研究尚有待完全闡明。SDH 是多元醇代謝通路中的一個酶，其作用是可逆地催化D－山梨醇氧化為D－果糖。目前對SDH 的研究不多，但SDH 在糖尿病腎病中發(fā)揮重要作用。其催化功能可以改變腎臟微環(huán)境之內(nèi)的活性氧自由基(ROS)生成，促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)展［4］。但SDH 在非糖尿病腎病的中的作用鮮見報(bào)道。bFGF 為體內(nèi)修復(fù)過程中的重要生長因子，可以調(diào)控大量細(xì)胞外基質(zhì)的合成、代謝，特別在促進(jìn)細(xì)胞增殖分裂過程中，發(fā)揮重要作用［5］。但是，bFGF 對于SDH 是否具有調(diào)控作用，目前未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過在大鼠MSC 培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)基中添加bFGF 后檢測SDH 的表達(dá)，并在抗Thy－1 模型的基礎(chǔ)上在體檢測了bFGF 對SDH 表達(dá)的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源施加bFGF 因子可以使大鼠腎臟系膜細(xì)胞SDH 的表達(dá)量升高，并且SDH升高的程度隨著作用時間延長和濃度增高而表達(dá)增強(qiáng)，呈現(xiàn)出時間、劑量依賴性。在ATG 動物模型中，隨著病程的延長，bFGF 和SDH 皆表達(dá)增高。這表明，bFGF 可以在體內(nèi)、體外上調(diào)SDH 的表達(dá)，這種上調(diào)可能使得SDH 參與了非糖尿病性的腎炎、腎纖維化和硬化過程，但其中的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

圖1 外源性bFGF 作用MsC 不同時間、不同濃度bFGF 作用MsC 24 h 后SDH mRNA 的表達(dá)

圖2 外源性bFGF 作用MsC 不同時間、不同濃度bFGF 作用MsC 24 h 后SDH 蛋白的表達(dá)

圖3 ATG 大鼠不同時段腎皮質(zhì)bFGF、SDH 蛋白的表達(dá)

［1］Haraguchi K，Shimura H，Ogata R，et al.Focal segmental glomerulosclerosis associated with essential thrombocythemia［J］.Clin Exp Nephrol，2006，10 (1):74－77.

［2］Abdel－Hamid NM，Nazmy MH，Abdel－Bakey AI.Polyol profile as an early diagnostic and prognostic marker in natural prod-uct chemoprevention of hepatocellular carcinoma in diabetic rats［J］.Diabetes Res Clin Pract，2011，92 (2):228－237.

［3］陳廣平，郭慕依，張?jiān)露?，?大鼠Thy1 抗血清制備及系膜增生性腎炎模型的建立［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，1996，12 (3):241－243.

［4］Forbes JM，Coughlan MT，Cooper ME.Oxidative stress as a major culprit in kidney disease in diabetes ［J］.Diabetes，2008，57 (6):1446－1454.

［5］Chujo S，Shirasaki F，Kondo－ Miyazaki M，et al.Role of connective tissue growth factor and its interaction with basic fibroblast growth factor and macrophage chemoattractant protein－1 in skin fibrosis ［J］.J Cell Physiol，2009，220 (1):189－195.