鞠雷，甄偉，臧東鈺

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院，遼寧 錦州 121001;2.盤錦市中心醫(yī)院，遼寧 盤錦 124000;3.遼東學(xué)院，遼寧 丹東 118000)

我國食管癌的發(fā)病率和死亡率高居世界首位［1］。盡管我國食管癌的診斷和治療水平處于世界領(lǐng)先地位，但綜合5 年生存率也在30% 左右，其根本原因還是無法做到早期診斷、早期治療。Hedgehog (Hh)信號傳導(dǎo)通路是一個經(jīng)典的胚胎發(fā)育信號通路［2］，近年研究發(fā)現(xiàn)它在多種腫瘤的發(fā)生、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用［3］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)，探討Hh 信號通路中核轉(zhuǎn)錄因子Gli－1 的異常激活與食管鱗癌間的關(guān)系，力爭為食管鱗癌的早期診斷和治療提供新的思路和線索。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 50 例食管鱗癌及癌旁組織標(biāo)本取自遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三和第一醫(yī)院2010—2012年手術(shù)切除存檔蠟塊?；颊呔鶠槟行?，年齡49～75 歲，平均62 歲。Gli－1 兔多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司，SABC 試劑盒購自武漢博士德生物制品有限公司。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 所有石蠟切片脫蠟水化，抗原修復(fù)，3%H2O2孵育，滴加一抗(1 ∶50)，4℃濕盒過夜，滴加二抗，37 ℃溫箱20 min，滴加SABC 液，37 ℃溫箱30 min，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水，透明，二甲苯封片。用已知的陽性對照片做陽性對照，PBS 代替一抗作陰性對照，光學(xué)顯微鏡下觀察并攝片。

1.3 結(jié)果判定 Gli－1 蛋白以胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)淺黃色至深棕色顆粒判斷為陽性細(xì)胞。隨機(jī)選取10個高倍視野，分別計(jì)數(shù)200 個細(xì)胞。以染色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞百分比綜合計(jì)分進(jìn)行定性分析。(1)計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比并分級，0～5%、5～25%、25～50%和＞50%分別對應(yīng)0、1、2 和3 分;(2)根據(jù)陽性細(xì)胞的著色強(qiáng)弱分級，陰性、淺黃色、棕色和深棕色分別對應(yīng)0、1、2 和3 分。兩項(xiàng)評分相加后進(jìn)行判斷，0 分、1～2 分、3～4 分和5～6 分分別對應(yīng)－ (陰性)、 + (弱陽性)、+ + (中度陽性)和+ + + (強(qiáng)陽性)。我們判定+ + / + + +為異常表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果 Gli－1 蛋白主要表達(dá)在胞質(zhì)或胞核，它在癌旁組織中表達(dá)較弱，但在鱗癌中表達(dá)明顯增強(qiáng)，二者比較有顯著性差異(圖1)。

2.2 Gli－1 在ESC 中的表達(dá)與臨床病例特征的關(guān)系 Gli－1 在ESC 及PC 中的表達(dá)與患者的年齡、病變部位無顯著相關(guān)(P ＞0.05)，但Gli－1 在ESC 中的表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM 分期密切相關(guān)(表1)。

表1 50例患者Gli－1 蛋白在食管鱗癌及癌旁組織中的表達(dá)與臨床病例特征的關(guān)系

3 討 論

近年來發(fā)現(xiàn)，一些在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化過程中起重要調(diào)控作用的信號傳導(dǎo)通路 (如Wnt、Norch、TGF 及Hedghoge 等)，在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要作用。Hh 信號傳導(dǎo)通路是一個經(jīng)典的胚胎發(fā)育信號通路，但在多種腫瘤組織中都存在Hh 信號通路的異常激活［4－6］，尤其是其上游配體Shh 和下游轉(zhuǎn)錄因子Gli－1 不同程度的激活，可以使得腫瘤細(xì)胞更具有侵襲性和轉(zhuǎn)移能力［7］。因此本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)技術(shù)并結(jié)合臨床資料，研究Hh 通路中Gli－1 蛋白在食管鱗癌中的表達(dá)及意義，以探討Hh 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活與食管鱗癌之間的關(guān)系。

Hh 信號通路主要由Hh 配體與膜蛋白受體Ptch 及Smo 組成復(fù)合物，其下游包含Gli、Fu、Su(Fu)等許多分子。當(dāng)Hh 大量存在時，Ptch 可與Shh 結(jié)合并解除對Smo 的抑制作用，Smo 可與信號通路下游的因子SU、FU 及Gli 等結(jié)合，使Gli 活化并進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種靶基因的表達(dá)。Gli 家族在脊椎動物中包括Gli－1、Gli－2 和Gli－3 三種轉(zhuǎn)錄因子。Gli－1 主要起激活目的基因轉(zhuǎn)錄的作用，同時也是該信號通路下游的目的基因分子，腫瘤組織中Gli－1mRNA 表達(dá)上調(diào)是該信號通路異?；罨臉?biāo)志［8］。Kogerman 等［9］報(bào)道，阻止Gli－1 入核可以抑制目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄激活，表明Gli－1 入核對于Hh 信號通路運(yùn)作非常重要。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Gli－1 蛋白主要表達(dá)在胞質(zhì)和胞核，它在癌旁食管組織中表達(dá)較低，但在癌組織中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而且隨著分化程度的降低和TNM 分期的升高，Gli－1 蛋白的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。因此我們認(rèn)為，在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能存在Hh 信號通路的異常激活。

許多參與腫瘤細(xì)胞增殖與擴(kuò)散的效應(yīng)分子均源于Hh 信號通路的靶基因或下游分子，且Hh 信號通路與其它調(diào)控腫瘤細(xì)胞分化、增殖的信號通路也有著交叉作用。因此，深入研究Hh 信號傳導(dǎo)通路與食管癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，對進(jìn)一步提高食管癌的診斷和治療水平具有重要意義。

圖1 Gli－1 在食管鱗癌中的表達(dá) ×400

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