金昊，谷景先，臧東鈺

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院，遼寧 錦州121001;2.遼寧省遼河油田總醫(yī)院，遼寧 盤錦 124000;3.遼寧省錦州軍分區(qū)后勤部，遼寧 錦州 121001)

食管癌的發(fā)生、發(fā)展涉及多種基因及不同信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常變化。近年來研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)與胚胎發(fā)育密切相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路－Hedgehog (Hh)信號(hào)通路，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要作用［1］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察Smo 蛋白的表達(dá)，探討Hh 信號(hào)通路中的膜蛋白受體Smo異常激活與食管鱗癌之間的關(guān)系，為研究Hh 信號(hào)通路對(duì)食管鱗癌影響的機(jī)制提供一些理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 50 例食管鱗癌及癌旁組織標(biāo)本取自遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院和附屬第一醫(yī)院2010—2012 年手術(shù)切除標(biāo)本。患者均為男性，年齡49～75 歲。Smo 兔多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司，SABC 試劑盒購自武漢博士德生物制品有限公司。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2孵育，蒸餾水沖洗，PBS 浸泡。高壓修復(fù)后自然冷卻，10% 正常山羊血清(PBS 稀釋)封閉。滴加一抗工作液(1 ∶50)，4 ℃過夜，PBS 沖洗。滴加生物素化山羊抗兔IgG/兔抗羊IgG，濕盒內(nèi)37℃孵育，PBS 沖洗。滴加SABC 試劑，濕盒內(nèi)37℃孵育。PBS 沖洗，DAB 顯色，核復(fù)染。自來水沖洗，脫水，透明，封片。

用已知的陽性對(duì)照片做陽性對(duì)照，以PBS 代替一抗作陰性對(duì)照。光學(xué)顯微鏡下觀察并攝片。

1.3 結(jié)果判定 由兩位病理醫(yī)師分別對(duì)染色結(jié)果作出判定。以胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)淺黃色至棕黃色顆粒判斷為陽性，以染色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞百分比綜合計(jì)分作定性分析［2］。隨機(jī)選取10 個(gè)高倍視野，分別計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞。 (1)按陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例分級(jí):0～5%、5～25%、25～50%、 ＞50% 對(duì)應(yīng)0、1、2、3 分。(2)根據(jù)陽性細(xì)胞的著色強(qiáng)弱分級(jí):陰性、淺黃色、棕色、深棕色對(duì)應(yīng)0、1、2、3 分。兩項(xiàng)評(píng)分結(jié)果相加進(jìn)行結(jié)果判斷，0 分、1～2 分、3～4 分、5～6 分分別對(duì)應(yīng)－ (陰性)、+ (弱陽性)、 + + (中度陽性)和+ + +(強(qiáng)陽性)。+ + / + + +為異常表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果 Smo 蛋白主要表達(dá)在胞膜和胞質(zhì)。Smo 在癌旁組織中不表達(dá)，但在鱗癌中呈高表達(dá)，二者比較有顯著性差異(P ＜0.05，圖1)。

2.2 Smo 在ESC 中的表達(dá)與臨床病例特征的關(guān)系Smo 在ESC 中的表達(dá)與患者的年齡、病變部位均無關(guān)(P ＞0.05)，但與與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(表1)。

表1 50例患者Smo 蛋白在食管鱗癌中的表達(dá)與臨床病例特征的關(guān)系

3 討 論

食管癌的發(fā)生、發(fā)展與其它惡性腫瘤一樣，都會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)多種基因的表達(dá)改變［3］，而這些改變最終會(huì)引起相關(guān)蛋白的表達(dá)水平發(fā)生變化。因此，尋找食管癌特異性的基因及其蛋白產(chǎn)物的變化，對(duì)于食管癌的診斷和治療具有重要意義。近年來，與胚胎發(fā)育密切相關(guān)的Hh 信號(hào)傳導(dǎo)通路逐漸進(jìn)入了腫瘤研究領(lǐng)域，并日益受到學(xué)者的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌、胃癌、基底細(xì)胞癌、胰腺癌等的發(fā)生、發(fā)展過程中，都存在Hh 信號(hào)通路的異常激活［1，4－7］12。

哺乳動(dòng)物的Hh 信號(hào)通路主要由Hh 配體、膜蛋白受體(包括Ptch 和Smo)及其下游的核轉(zhuǎn)錄因子和目的基因組成。一般認(rèn)為缺乏Hh 配體時(shí)，Ptch與Smo 組成受體復(fù)合物并抑制Smo 活性;而當(dāng)Hh大量存在時(shí)將與Ptch 結(jié)合，解除了Ptch 對(duì)Smo 的抑制作用，Smo 被激活并將信號(hào)下傳，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子Gli 被激活并進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)下游目的基因的表達(dá)［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Smo 蛋白主要表達(dá)在胞膜和胞質(zhì)，這與其膜蛋白受體的身份相符。本實(shí)驗(yàn)在癌旁組織中未能檢測(cè)到Smo 蛋白的表達(dá)，但在食管鱗癌中Smo 蛋白則呈高表達(dá)，且其表達(dá)與食管鱗癌的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。推測(cè)Smo 蛋白可能參與了食管鱗癌的發(fā)生和發(fā)展過程。

Kiselyov、Lauth 等［9－10］分別利用針對(duì)Smo 蛋白的特異性小分子抑制劑環(huán)靶明進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在抑制Smo 蛋白的活性后，多種腫瘤細(xì)胞的生長都受到了明顯的抑制。但是，Smo 如何被激活的以及Smo 究竟怎樣通過Gli 基因家族發(fā)揮作用等尚不明了。因此，進(jìn)一步深入了解Hh 信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用機(jī)制及其與食管癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，將有可能為食管癌診斷和治療提供理想的分子靶標(biāo)。

圖1 Smo 在食管鱗癌中的表達(dá) ×400

［1］Zunieh SM，Doughs T，Valdo riIxm M，et al.Paracrine sonic hedgehog Signailing by prostate cancer cells induces osteoblast differentiation ［J］.Mol Cancer，2009，8:12.

［2］Liao X，Siu MK，Au CW，et al.Aberrant activation of hedgehog signaling pathway in ovarian cancers:effect on prognosis，cell invasion and differen－tiation ［J］.Carcinogenesis，2009，30 (1):131－140.

［3］Peter C，Enzinger and Robert J，Mayer.Esophageal Cancer［J］.N Engl J Med，2003，349 (23):2241－2252.

［4］Kathadkar S，Bova GS，Abdallah N，et al.Hedgehog signalling in Prostate regeneration，neoplasia and metastasis ［J］.Nature，2004:Oct 7，431 (7009):707－712.

［5］Bai CB，Arerbach W，Lee JS，et al.Gli2，but not Glil，is required for initial SHH singaling and ectopic activation of the SHH Pathway ［J］.Development，2002，129 (20):4753－4761.

［6］Chen M，Tanner M，Levine AC，et al.Androgenic regulation of Hedgehog signaling pathway components in prostate cancer cells ［J］.CeU Cycle，2009，8:149－157.

［7］Thayer SP，di Magliano MP，Heiser PW，et al.Hedgehog is an early and late Mediator of Pancreatic cancer tumorigenesis［J］.Nature，2003，425 (6960):851－856.

［8］Muorne M，Rosenthal A，de Sauvage FJ.Sonic hedgehog singaling by the patched－smoothened receptor complex ［J］.CurrBiol，1999，9 (2):76－84.

［9］Kiselyov AS.Targeting the Hedgehog signaling pathway with small Molecules［J］.Anticance rAgents Med Chem，2006，6 (5):445－449.

［10］Lauth M，Bergstrêm A，S himokawa T，et al.Inhibition of GLI－mediated transcription and tumor cell growth by smal－lmolecule antagonists ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104 (20):8455－8460.