趙 霞，賈 苗，王 磊，曹廣春*，張澤華

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽(yáng) 110161;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所農(nóng)業(yè)部生物防治重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

東亞飛蝗Locusta migratoria manilensis，Meyen是重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)之一，在國(guó)內(nèi)外分布比較廣泛(洪曉月和丁錦華，2007)。自2010年以來(lái)，隨著氣候的異常變化和生態(tài)環(huán)境的改變，蝗災(zāi)的發(fā)生比較頻繁，其中澳大利亞?wèn)|南部、新疆伊犁河谷以及河南黃河沿岸等地遭受?chē)?yán)重的蝗蟲(chóng)災(zāi)害，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，大量用于蝗災(zāi)防治的有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑馬拉硫磷，具有殺蟲(chóng)譜廣、低毒高效、殘效期短、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，并有良好的胃毒、觸殺和一定的熏蒸作用，且對(duì)人畜無(wú)害(賀紅武和劉釗杰，2001)。

隨著馬拉硫磷殺蟲(chóng)劑的過(guò)量施用，害蟲(chóng)對(duì)藥物的敏感性發(fā)生變化并產(chǎn)生一定抗性。目前對(duì)其抗性的生化機(jī)制研究如下:昆蟲(chóng)乙酰膽堿酯酶(AChE)活性升高是產(chǎn)生馬拉硫磷抗性的一個(gè)重要機(jī)制(唐振華和周成理，1992;Fournier et al.，1993;Zhu et al.，1999;Taskin et al.，2004;Magana et al.，2007;)，其他可能的因素有酯酶(Ests)活性的升高(高希武等，1992;Zhu et al.，1999;Magana et al.，2007);多功能氧化酶(MFO)活性的升高(Motoyama et al.，1980)以及谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性的變化(Motoyama et al.，1980;高希武等，1992;Taskin et al.，2004;何艷萍等，2005)。當(dāng)前研究重點(diǎn)大多集中于馬拉硫磷抗性機(jī)制研究，而馬拉硫磷對(duì)解毒代謝酶的影響還未見(jiàn)報(bào)道，嚴(yán)重地阻礙了其抗性延緩和治理策略的制定。

本實(shí)驗(yàn)以東亞飛蝗為研究對(duì)象，在浸葉法測(cè)定馬拉硫磷對(duì)東亞飛蝗3齡蝗蝻毒力的基礎(chǔ)上，研究了其對(duì)解毒代謝酶的影響，以期為馬拉硫磷的合理使用、抗性延緩和抗性治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

東亞飛蝗蝗卵2007年采集于河北滄州，室內(nèi)孵化飼養(yǎng)傳代至今，未接觸過(guò)任何殺蟲(chóng)劑。蟲(chóng)卵在人工氣候培養(yǎng)箱中孵化，溫度(30±2)℃，濕度為(60+5)%，光照時(shí)間∶黑暗時(shí)間=14 h∶10 h。將同一時(shí)間孵化的蝗蝻轉(zhuǎn)移到60 cm×50 cm×70 cm 規(guī)格的養(yǎng)蟲(chóng)籠中用新鮮小麥和麥麩飼養(yǎng)傳代。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 供試試劑

馬拉硫磷原藥由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所農(nóng)藥研究室提供;DTNB(5，5－二硫雙(2－硝基苯甲酸))、ATChI(碘化硫代乙酰膽堿)、考馬斯亮藍(lán)G－250、CDNB(1－氯－2，4－二硝基苯)、DCNB(1，2－二氯－4－硝基苯)均為Sigma 產(chǎn)品;α－NA(乙酸－1－萘酯)、p－NA(對(duì)硝基苯甲醚)、NADPH(還原型輔酶II)均購(gòu)自Amresco 公司;GSH(還原型谷胱甘肽)、固藍(lán)RR 鹽、牛血清蛋白購(gòu)自Solarbio 公司;其余藥品為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2.2 供試儀器

智能人工氣候箱(寧波海曙塞福實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng))、立式壓力蒸氣滅菌器(上海博訊實(shí)驗(yàn)有限公司)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、SartoriusBS224S 天平、3K15 型冷凍離心機(jī)(Sigma 公司)、H2O3－PRO 恒溫金屬浴(金銀杏生物科技有限公司)、VERSAmax 型酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Device 公司)。

1.3 生物測(cè)定

試驗(yàn)采用浸漬葉片法(陳年青，1990)測(cè)定馬拉硫磷對(duì)蝗蟲(chóng)的毒力效果，首先將馬拉硫磷原藥用丙酮配制成一定濃度的母液，然后用雙蒸水將母液稀釋為不同濃度。將新鮮無(wú)污染的小麥葉，浸在不同濃度的藥液中5 s 后取出，室內(nèi)晾干后等量放入飼養(yǎng)盆中。挑選大小一致的3齡蝗蟲(chóng)若蟲(chóng)，每個(gè)處理15頭，重復(fù)次數(shù)為3，并用雙蒸水作為對(duì)照，飼養(yǎng)于養(yǎng)蟲(chóng)室，每天統(tǒng)計(jì)死亡蟲(chóng)數(shù)。以解剖針輕觸蟲(chóng)體，無(wú)明顯反應(yīng)者為死亡。

計(jì)算處理死亡率，并采用SPSS 數(shù)據(jù)處理軟件(賈春生，2006)計(jì)算馬拉硫磷48 h和72 h 的毒力回歸方程及LC50和95%置信區(qū)間。

1.4 酶液的制備

取馬拉硫磷藥物處理48 h 后存活的蝗蟲(chóng)，加入適量0.1 M 的磷酸鹽緩沖液(酯酶:緩沖液pH 7.0，1.5mL/頭，含0.1%TritonX－100;多功能氧化酶O－脫甲基活力:pH7.3，1mL/頭含1 mM EDTA和1 mM DTT;谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶:pH7.5，1.5mL/頭;乙酰膽堿酯酶:pH7.0，1.5mL/頭)冰浴勻漿3 min，勻漿液在10，000 rpm、4℃條件下離心10 min。取上清液在15，000 rpm、4℃條件下再離心20 min，所獲得的上清液用作酶活性測(cè)定。

1.5 酶活的測(cè)定

1.5.1 蛋白含量測(cè)定

酶液中蛋白含量采用Bradfold(1976)考馬斯亮藍(lán)方法，牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用酶標(biāo)儀在595 nm 處讀取OD 值，計(jì)算樣品蛋白含量。

1.5.2 全酯酶活性測(cè)定

參考韓召軍等(Han et al.，1998)方法，在酶標(biāo)板加樣孔中依次加90μL 0.1 M pH7.0 磷酸鹽緩沖液、200μL 底物與顯色劑的混合液(α－NA 10 mg、固藍(lán)RR 20 mg 分別溶于1mL 丙酮，分別取200μL 用緩沖液定容至8mL，過(guò)濾。)，最后加入10μL 酶液。迅速置于酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下，每隔25 s 記錄一次光密度值，共記錄10 min，樣品測(cè)定時(shí)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，酶促反應(yīng)溫度為27℃，數(shù)據(jù)記錄和處理由Softmax Pro 6.1 軟件進(jìn)行。

1.5.3 谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定

參照Oppenoorth(1976)報(bào)道的方法，以CDNB 為底物時(shí)，在96 孔酶標(biāo)板中每孔分別加入90μL 0.1 M pH7.5 磷酸鹽緩沖液，10μL 酶液，100μL 1.2 mM CDNB和100μL 6 mM GSH。以DCNB 為底物時(shí)，在96 孔酶標(biāo)板中每孔加入50μL酶液，100μL 1.2 mM DCNB和100μL 6 mM GSH。置于酶標(biāo)儀在340 nm 波長(zhǎng)下，每隔25 s 記錄一次光密度值，共記錄10 min，樣品測(cè)定時(shí)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，酶促反應(yīng)溫度為27℃，數(shù)據(jù)記錄和處理由Softmax Pro 6.1 軟件進(jìn)行。

1.5.4 多功能氧化酶O－脫甲基活力測(cè)定

參照Hansen和Hodgson(1971)的方法，在96 孔酶標(biāo)板中，每孔依次加入100μL 2mM 的p－NA、50μL 酶液，在27℃下溫育2min，然后加入40μL，9.6 mM 的NADPH。置于酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)下，每隔25 s 記錄一次光密度值，共記錄10 min，樣品測(cè)定時(shí)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，酶促反應(yīng)溫度為27℃，數(shù)據(jù)記錄和處理由Softmax Pro 6.1 軟件進(jìn)行。

1.5.5 乙酰膽堿酯酶活性測(cè)定

參考韓召軍等方法(Han et al.，1998)，在酶標(biāo)板加樣孔中依次加50μL，0.1M pH7.0 磷酸鹽緩沖液、50μL 酶液、100μL 45 μM DTNB和100μL 1.5 mM ATChI。置于酶標(biāo)儀在405 nm 波長(zhǎng)下，每隔30 s 記錄一次光密度值，共記錄40個(gè)值，樣品測(cè)定時(shí)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，酶促反應(yīng)溫度為27℃，數(shù)據(jù)記錄和處理由Softmax Pro 6.1 軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬拉硫磷對(duì)東亞飛蝗的毒力測(cè)定

馬拉硫磷對(duì)東亞飛蝗3齡蝗蝻室內(nèi)毒力測(cè)定，結(jié)果表明:處理48 h 的LC50值為448.89 mg/L，處理72 h 的LC50值為315.61 mg/L。

2.2 不同濃度馬拉硫磷處理東亞飛蝗相關(guān)生化酶活性變化

從表1 中可以看出，取接近于LC0(7.48 mg/L)、LC5(37.4 mg/L)、LC30(187 mg/L)的3個(gè)馬拉硫磷濃度處理東亞飛蝗48h 后，其體內(nèi)的解毒酶活性出現(xiàn)了一定變化。全酯酶(Ests)和乙酰膽堿酯酶(AChE)活性受到抑制并且變化趨勢(shì)相同，當(dāng)濃度為37.4 ppm 時(shí)，其酶活性分別為對(duì)照組的0.28和0.32倍。分別以CDNB和DCNB 為底物測(cè)定東亞飛蝗谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性，其變化趨勢(shì)不同。以CDNB 為底物時(shí)，經(jīng)低濃度馬拉硫磷處理后東亞飛蝗GSTs 活性受到抑制，但是當(dāng)處理濃度為187 ppm 時(shí)其活性被誘導(dǎo)升高1.35倍;以DCNB 為底物時(shí)，測(cè)得東亞飛蝗GSTs比活力較小，但是其活性呈現(xiàn)先升高后降低的誘導(dǎo)趨勢(shì)，當(dāng)馬拉硫磷濃度為37.4 ppm 其活性最高為1.34倍。多功能氧化酶(MFO)活性受到抑制，但無(wú)顯著性差異，濃度為7.48 ppm 時(shí)活性最低為0.68倍。

表1 馬拉硫磷對(duì)東亞飛蝗的毒力Table 1 Toxicity of malathion to Locusta migratoria manilensis

表2 不同濃度馬拉硫磷處理下東亞飛蝗相關(guān)酶活性Table 2 The enzymes activities assays of Locusta migratoria manilensis to malathion

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以3齡東亞飛蝗為測(cè)定對(duì)象，用馬拉硫磷殺蟲(chóng)劑進(jìn)行了室內(nèi)毒力測(cè)定，并分析了東亞飛蝗體內(nèi)解毒代謝酶的變化趨勢(shì)。試驗(yàn)結(jié)果表明馬拉硫磷作用72 h 后對(duì)東亞飛蝗的LC50值為315.61 mg/L 。紀(jì)明山等(2012)對(duì)草原蝗蟲(chóng)毛足棒角蝗和亞洲小車(chē)蝗3齡若蟲(chóng)進(jìn)行了室內(nèi)藥劑的篩選試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬拉硫磷對(duì)這兩種蝗蟲(chóng)毒力最低，72h 的LC50值分別為422.9821 mg/L和317.8538 mg/L。李翠蘭等(2005)報(bào)道山西晉源地區(qū)的中華稻蝗5齡若蟲(chóng)經(jīng)馬拉硫磷作用24 h，其LC50值為549 mg/L。上述結(jié)果說(shuō)明馬拉硫磷對(duì)不同的蝗蟲(chóng)具有相近的毒力效果，因此可用于蝗蟲(chóng)的大面積混合防治，而不會(huì)出現(xiàn)防效不一的結(jié)果。

已知馬拉硫磷主要作用于乙酰膽堿酯酶(AChE)靶標(biāo)酶，使AChE 活性部位磷酰化而抑制其活性，引起乙酰膽堿在突觸間作用時(shí)間延長(zhǎng)，從而引起突觸后膜乙酰膽堿受體的超興奮，使昆蟲(chóng)痙攣死亡(張宗炳和曹驥，1990)。劉波(2003)等報(bào)道LD10劑量的馬拉硫磷誘導(dǎo)了棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera 體內(nèi)的AChE 的活性。但是亞致死劑量的馬拉硫磷作用24 h 后抑制花翅搖蚊Chironomus kiiensis 體內(nèi)的AChE 活性(劉洪霞，2005)。本研究發(fā)現(xiàn)馬拉硫磷處理48 h 后，抑制了東亞飛蝗AChE 活性，并且隨著馬拉硫磷濃度的升高呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。不同的昆蟲(chóng)經(jīng)馬拉硫磷處理后體內(nèi)AChE 活性變化情況不同，這可能與昆蟲(chóng)的處理方式和AChE 活性測(cè)定方法不同有關(guān)，但對(duì)體內(nèi)AChE 的抑制被認(rèn)為是最可能的結(jié)果，在馬拉硫磷抗性機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)AChE 活性升高是造成昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性的重要原因(Zhu et al.，1995)。

殺蟲(chóng)劑進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)，常常會(huì)遭受不同酶系的進(jìn)攻，與此相關(guān)的主要有酯酶、谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶、多功能氧化酶(冷欣夫和唐振，1996)。劉澤文等研究發(fā)現(xiàn)在馬拉硫磷的抗性發(fā)展過(guò)程中，褐飛虱酯酶活性在不斷的上升，并且存在較好的相關(guān)性;而多功能氧化酶和谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶只在抗性發(fā)展的最初階段起到一定的作用(劉澤文等，2003)。在本試驗(yàn)中東亞飛蝗全酯酶、谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶(以CDNB 為底物)和多功能氧化酶都被抑制，但全酯酶、谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶(以CDNB 為底物)的活性隨著馬拉硫磷濃度的升高呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，而MFO 活性變化不明顯。由此推測(cè)乙酰膽堿酯酶、全酯酶和谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶活性的上升可能是導(dǎo)致東亞飛蝗對(duì)馬拉硫磷抗性發(fā)展的重要原因之一，多功能氧化酶活性的變化可能促進(jìn)了其抗性的發(fā)展。

明確馬拉硫磷對(duì)昆蟲(chóng)體內(nèi)解毒代謝酶的影響，可為其抗性的延緩和抗性治理奠定一定的理論基礎(chǔ)。針對(duì)抗性的問(wèn)題，劉澤文(劉澤文等，2004)研究發(fā)現(xiàn)在馬拉硫磷抗性品系中磷酸三苯酯(TPP)對(duì)馬拉硫磷的增效作用達(dá)到9.15倍，增效劑的使用可以增強(qiáng)馬拉硫磷的毒力，降低抗性的影響。因此，作為延緩或者阻止抗性發(fā)展的主要手段，殺蟲(chóng)劑與增效劑混用、不同作用機(jī)理的殺蟲(chóng)劑混用和殺蟲(chóng)劑的輪用等措施將勢(shì)在必行。

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