管慶松 袁雪波 項 勛 代飛燕* 肖 嘯（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 云南 昆明 650201云南省紅河州動物疫病預(yù)防控制中心 云南 蒙自）

馬蹄香(Valeriana jatamansi Jones)又名蜘蛛香、土細(xì)辛、印度纈草等，系敗醬科纈草屬植物。馬蹄香生于土壤潮濕、富含有機質(zhì)的地方，常見于海拔1800～2500m疏林或灌木林下或溪溝、田埂邊。云南全省及四川、貴州、陜西等省有分布[1]。馬蹄香首載于《本草綱目》，《滇南本草》中亦有記載，是云南地區(qū)常用的藥物之一。云南民間用其治療心腹疼痛、風(fēng)濕麻木及筋肉酸痛等[2]。馬蹄香用于治療胃腸道疾病有較好的療效，如消化不良，嘔吐腹瀉，小兒疳積，腹脹，食少，胃氣痛等[3]。其化學(xué)成分主要含揮發(fā)油、環(huán)烯醚萜類、黃酮類等多種成分[4,5]。大腸桿菌病是一種重要的人畜共患病，該病的病原為致病性大腸埃希菌。對豬大腸桿菌病的治療，養(yǎng)豬戶大多采用抗生素和抗菌類藥物。但不合理用藥加速了豬大腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生和擴大，給該病的防治帶來困難[6]。本試驗用馬蹄香提取物對分離鑒定的仔豬腸道大腸桿菌菌株進(jìn)行體外抑菌試驗，觀察馬蹄香提取物對大腸桿菌的抑菌效果，為云南馬蹄香資源的利用和豬致病性大腸桿菌的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料的采集 在昆明富民懇寧養(yǎng)豬場，無菌采取發(fā)病仔豬直腸深部的糞便及其腸內(nèi)容物各2份，每份約0.5g。

1.1.2 試驗器材 生物顯微鏡、托盤天平、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、蒸汽滅菌器、接種環(huán)等。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑 麥康凱瓊脂平板、普通瓊脂平板、伊紅美藍(lán)瓊脂平板、普通瓊脂斜面、肉湯培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基、靛基質(zhì)試劑、吲哚試劑等。

1.1.4 試驗動物 健康昆明種小鼠10只，分成試驗和對照2個組，每組5只。

1.1.5 受試藥物 馬蹄香，購于昆明市菊花村中草藥集市，經(jīng)過藥材市場專門加工機加工成馬蹄香粗粉。慶大霉素、鏈霉素、林可霉素、頭孢氨芐等。

2.2 大腸桿菌分離及馬蹄香提取

2.2.1 大腸桿菌分離 分離培養(yǎng)、分離菌生化試驗、形態(tài)觀察及動物致死性試驗參照方定一[7]方法進(jìn)行。

2.2.2 馬蹄香藥液提取制備 取馬蹄香粗粉10g，于圓底燒瓶中，加入95%乙醇100ml，水浴回流1h，冷卻，過濾得濾液A。在盛有藥渣的燒瓶中加無菌蒸餾水100ml，水浴回流1h，冷卻，得濾液B，將兩濾液混合，減壓濃縮呈浸膏，加無菌蒸餾水稀釋至1g/ml的馬蹄香提取液。

2.3 體外抑菌試驗

2.3.1 紙片擴散法 將馬蹄香提取液分別稀釋、濃縮成0.25、0.5、1、2、4g/ml的藥液濃度，每種藥液分別用滅菌紙片(直徑6mm)浸透，將含馬蹄香的滅菌紙片平置于已經(jīng)涂布好的大腸桿菌平板表面，置于37℃培養(yǎng)24h后取出，測量各紙片周圍抑菌圈直徑。并在另一塊涂布好的大腸桿菌平板表面平置慶大霉素、鏈霉素、林可霉素、頭孢氨芐、頭孢曲松鈉的標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片以作對比。

2.3.2 牛津小杯法 將經(jīng)過高壓滅菌后的牛津小杯豎立放置于已經(jīng)與涂布好的大腸桿菌平板表面上，每個小杯中分別加入0.25、0.5、1、2、4g/ml濃度的藥液0.2ml，37C培養(yǎng)24h，以抑菌圈直徑評定藥物的抑菌作用。

2.3.3 平皿法 馬蹄香提取液按無菌法依次稀釋成0.2g/ml、0.1g/ml、0.05g/ml、0.025g/ml和0.0125g/ml。分別將已稀釋藥液與10ml普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混勻，制成含藥物的平板培養(yǎng)基，其含馬蹄香的濃度分別為0.02、0.01、0.005、0.0025和0.00125g/ml。用接種環(huán)蘸取1:1000的大腸桿菌懸液，以劃線接種于上述含藥平板內(nèi)，37℃培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌在不同濃度藥物平板上生長情況，細(xì)菌不生長的最低濃度即為該藥物對該菌的最小抑菌濃度(MIC值)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)特性

在普通瓊脂平板上生長的菌落光滑、灰白、濕潤、圓形、邊緣整齊、稍有隆起；麥康凱瓊脂平板上生長的菌落圓形、紅色、邊緣整齊；伊紅美藍(lán)瓊脂平板上形成黑色帶金屬光澤的菌落；普通肉湯中可觀察到肉湯變渾濁，底部有絮狀物沉淀。

2.2 形態(tài)特征

細(xì)菌涂片，革蘭氏染色，光鏡檢查，可見該菌為兩端略顯鈍圓的中等大小桿菌、散在或成對存在、兩端著色較深、革蘭氏染色陰性。

2.3 生化特性

三糖鐵試驗中，培養(yǎng)液呈現(xiàn)黃色，并伴有氣泡產(chǎn)生；吲哚試驗中，培養(yǎng)液呈現(xiàn)紅色；甲基紅試驗中，培養(yǎng)液呈現(xiàn)紅色。生化試驗結(jié)果符合大腸桿菌的特征。

2.4 動物致死性試驗

24h內(nèi)，試驗組5只小鼠除1只發(fā)病未致死外，其余4只全部死亡，發(fā)病率100%，致死率80%，而對照組小鼠正常。由此證明本次分離的大腸桿菌為致病性大腸桿菌，并具有高致病性。

2.5 體外抑菌試驗

2.5.1 紙片擴散法和牛津小杯法法試驗結(jié)果

表1 紙片擴散法藥敏試驗結(jié)果（mm、g/ml）

由表1可知，中藥馬蹄香在0.25、0.50、1.00、2.00、4.00g/ml不同濃度時，通過紙片擴散法測得抑菌圈直徑分別為7.2、7.5、8.4、10.2、13.4mm。經(jīng)牛津小杯法測得的抑菌圈直徑分別為10.8、13.0、15.6、18.0、20.2mm。隨著中藥馬蹄香藥提取液濃度的增加，抑菌圈直徑增大。同時，對比5種抗生素的抑菌圈直徑，高濃度的馬蹄香提取液抑菌效果與部分抗生素接近。

2.5.2 平皿法實驗結(jié)果 平皿試驗中，0.02g/ml濃度的馬蹄香提取液的平皿中無細(xì)菌生長，而0.01g/ml的平皿中看到有少量菌落散在生長，0.00125、0.0025、0.005g/ml的平皿上有大量大腸桿菌菌落生長，因此確定中藥馬蹄香提取液的最小抑菌濃度MIC值為0.02g/ml，稀釋度為1:50。

3 討論

豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的一類仔豬腸道傳染性疾病的總稱，是仔豬的一種常見病和多發(fā)病。長期以來，該病的防治主要依靠抗生素等化學(xué)藥物。然而，抗生素等藥物的大量使用引起藥物殘留和細(xì)菌、病毒產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)一步加大疾病控制的難度。本試驗中，根據(jù)細(xì)菌形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性及動物致病性試驗，確定從發(fā)病仔豬的糞便、腸內(nèi)容物中分離的細(xì)菌為致病性大腸桿菌。體外抑菌試驗結(jié)果表明，中藥馬蹄香對仔豬致病性大腸桿菌具有較強的抑制作用，抑菌效果隨著藥液濃度的升高呈現(xiàn)高效性，其最小抑菌濃度MIC值為0.02g/ml。另外，藥敏紙片法結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，仔豬大腸桿菌的抑菌效果從大到小順序為慶大霉素>頭孢氨芐>鏈霉素=頭孢曲松鈉>高濃度馬蹄香藥液>中濃度馬蹄香藥液>低濃度馬蹄香藥液>林可霉素。馬蹄香提取液對大腸桿菌的抑菌作用隨濃度的升高而效果增強，雖抑菌效果比慶大霉素、頭孢氨芐稍差，但接近于林可霉素和鏈霉素。王珊等(2011)[8]研究表明：馬蹄香對犬細(xì)小病毒性腸炎有較好治療效果。馬靜等( 1987)[9]研究顯示，馬蹄香是治療小兒輪狀病毒性腹瀉的有效藥物，馬蹄香煎劑及散劑都能使腸蠕動受到抑制，可縮短腸炎腹瀉時間。Wang等(2008)[4]報道，馬蹄香中含有的萜類化合物具有廣譜抗菌活性。推測馬蹄香可抑制多種腸道細(xì)菌的新陳代謝、生長繁殖。本試驗結(jié)果也證實，馬蹄香對豬致病性大腸桿菌有抑菌效果，但作用機理尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。在迫切需要解決抗生素殘留和耐藥性問題的今天，中藥馬蹄香的應(yīng)用效果逐步顯現(xiàn)，值得深入研究開發(fā)利用。

4 結(jié)論

馬蹄香藥液對仔豬大腸桿菌有很好的抑菌效果，抑菌作用隨著藥液濃度的升高而呈現(xiàn)高效性。本試驗中，馬蹄香對仔豬大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.02g/ml。

[1]馬麗娟,李鵬,宋宇等.馬蹄香含藥血清對小鼠脾淋巴細(xì)胞和腹腔巨嗜細(xì)胞的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(29): 16230-16231.

[2]毛曉健,李靜平,王軍.蜘蛛香鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用及對胃腸運動的影響[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2008,31(3): 34-37.

[3]閆興麗.馬蹄香環(huán)烯醚萜對腸易激綜合征的治療作用及機理探討[D].北京: 北京中醫(yī)藥大學(xué),2009.

[4]Wang R，Xiao D，Bian YH，et al.Minor iridoids from the roots of Valeriana wallichii[J].J Nat Prod,2008,71(7): 1254-1257.

[5]陳業(yè)高,于麗麗,張燕.馬蹄香化學(xué)成分的分離與鑒定[J].云南化工,2005,32(5): 13-16.

[6]王秀梅,蔣紅霞,廖曉萍等.豬源致病性大腸桿菌的血清型、毒力基因及抗菌藥耐藥性的調(diào)查[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,43(19): 4109-4115.

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[9]馬靜,劉寶源,張新生等.馬蹄香治療小兒病毒性腹瀉機理研究[J].云南中醫(yī)雜志,1987,8(4): 1-3.