黃金波
(江蘇省新沂市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 221400)
犬的部分器官切片的制備
黃金波
(江蘇省新沂市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 221400)
犬做為實驗動物,目前已被廣泛應用于藥物試驗、毒理學、分子生物學和免疫學,功能與疾病、動物模型等領域的研究。因此研究正常犬的肝臟與腎臟的組織結構能夠為臨床診治患病犬、為臨床給藥的藥效學研究提供基本組織學依據(jù)。
1.1 樣品的采集與固定 新沂地區(qū)健康成年雜種犬1只,以20g/L戊巴比妥鈉麻醉加頸動脈放血處死。采取肝、腎組織樣品,經(jīng)10 %中性福爾馬林溶液固定。
1.2 儀器與試劑 光學顯微鏡(O1ympus),顯微成像系統(tǒng)(O1ympus)和組織切片機(LEICA RM2015)。試劑有福爾馬林、無水乙醇、二甲苯、蘇木精和伊紅等。
1.3 組織切片的制備 (1)脫水與透明:將固定好的犬的肝臟與腎臟投入酒精脫水,經(jīng)過70%、85%、95%I、95%II酒精各1h,100%I、100%II酒精各45min脫水,保證組織中水分脫除干凈。然后入二甲苯I、二甲苯II各7min。(2)透蠟:在透蠟以前,先將蠟放入溫箱內融化,溫箱溫度保持約55~60℃,將己經(jīng)透明的組織放入二甲苯和石蠟混合液內30min,然后入純蠟1,2杯各透蠟1h。(3)包埋:將溶好的石蠟注入包埋筐內,用鑷子夾取組織放入筐的適當位置,將要切的面朝向筐的底部。輕輕移入冷水中,待石蠟全部變硬即取出,在石蠟表面貼上有標本號碼的標簽紙。(4)修切蠟塊:剝出蠟塊,將蠟塊修切成正方形,將組織塊以外的多余石蠟修去,在組織四周留有少許石蠟,蠟塊兩邊必須切成平行的直線,避免切下的蠟條彎曲。(5)切片:用切片機LEICA RM2015進行切片,刀的傾斜角為30度左右;將蠟塊固定在切片機上,調整刻度指針到5μm,用右手握轉輪把柄,搖轉切片機,左手持一毛筆托住蠟帶,隨著切片機的轉動,輕輕把蠟帶拉開,用毛筆托住蠟帶,挑斷后順序放在紙上。(6)貼片、烤片:用一大燒杯盛溫水,放入42℃恒溫水浴鍋內,將蠟片攤于水面上,蠟片受熱自然張開浮游在水面上。將載玻片伸入水中把蠟片移至玻片上,撥正位置,傾去多余水滴后放入37℃溫箱中烤干,經(jīng)過10h后取出。(7)染色:將組織切片經(jīng)過二甲苯I、二甲苯II各10min進行脫蠟,經(jīng)過100%I、100%II酒精各1min,95%I、95%II酒精各2min,85%酒精1min,入蒸餾水1min。蘇木素液染色液7min,流水沖洗1min,1%鹽酸-乙醇1~3s,流水沖洗1~2min,蒸餾水洗1min,0.5%伊紅液染色2min,蒸餾水稍洗1~2s,80%酒精1~2s,95%酒精I、95%酒精II各2min,100%I、100%II酒精各5min,二甲苯I5min,二甲苯II10min,中性樹膠封片。(8)拍照:中性樹膠封片后,組織切片用O1ympus顯微鏡觀察并拍照。
2.1 肝臟的組織結構
圖1 肝組織結構×40
圖2 肝組織結構×400
肝臟表面被膜極薄,被膜下毛細血管非常豐富。肝小葉間無結締組織,小葉間分界不清。肝細胞呈多邊形,核圓形,肝細胞排列較緊密,呈不規(guī)則條索狀形成肝細胞索,向四周延伸,在肝細胞索(肝板)之間是血竇,肝細胞索呈彎曲、分支和吻合狀態(tài)(圖1)。肝內結締組織極少,主要分布在門管區(qū)周圍,門管區(qū)內含門靜脈、肝動脈和膽管分支(圖2)。
2.2 腎臟的組織結構
圖3 腎組織結構×100
圖4 腎組織結構×400
腎單位是組成腎臟的結構和功能的基本單位,腎單位包括腎小囊、腎小球和腎小管。腎小球是由毛細血管網(wǎng)組成的,腎小球外有腎小囊的包囊,囊腔與腎小管相通(圖3,圖4)。
3.1 組織的固定 在組織固定的過程中,應將標本于離體后,盡快浸泡于裝有足夠量固定液的容器中固定。固定液量應為被固定標本體積的5~10倍。切取的標本置放于容器中固定后,應盡快修整繼續(xù)固定。對未能及時、充分固定的標本用于制做切片。
3.2 組織的透明與浸蠟 組織塊在二甲苯中透明的時間不宜過長,組織呈現(xiàn)透明即可,以防組織硬、脆,尤其是肝臟的組織塊在透明的過程中更應注意到這點。若組織經(jīng)二甲苯透明不充分,則在之后的浸蠟過程中,蠟不容易侵入組織塊內。浸蠟時間適宜,過短時浸蠟不充分,組織會過軟,過長時組織硬脆。
3.3 切片的染色 在組織切片染色過程中,要不斷改變時間,摸索出蘇木精與伊紅的停留時間,用顯微鏡控制細胞核的蘇木素染色質量,使細胞核和細胞質顏色鮮明,對比清晰。
S852.16+2
B
1007-1733(2013)02-0071-01
2012–12–07)