周訓(xùn)美，趙 倩，李 建，陳 袁，李顯文

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，貴州遵義 563099)

本研究通過(guò)檢測(cè)糖尿病大鼠肺組織MMP－2的表達(dá)，以及不同胰島素干預(yù)時(shí)間肺組織內(nèi)MMP－2表達(dá)的變化，探討精蛋白鋅胰島素對(duì)糖尿病大鼠肺組織內(nèi)MMP－2表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 8周齡體重180～240g的Sprague Dawley雄性大鼠60只，清潔級(jí)，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，按普通級(jí)飼養(yǎng)。高糖高脂飼料購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，配置比例:基礎(chǔ)飼料70%，豬油9%，白糖12%，雞蛋9%。鏈脲佐菌素購(gòu)自美國(guó)Sigma生物公司。精蛋白鋅胰島素購(gòu)自江蘇萬(wàn)邦藥業(yè)有限公司。穩(wěn)豪血糖儀及血糖試紙條購(gòu)自美國(guó)強(qiáng)生公司。MMP－2一抗、二抗購(gòu)自武漢博士德生物公司。

1.2 動(dòng)物模型的建立 8周齡180～240 g的SD雄性大鼠，隨機(jī)分為3組。對(duì)照組(n=20)普通飼料飼養(yǎng)3周后給予0.1 mmol/L、pH值4.4的枸櫞酸緩沖液向腹腔內(nèi)注射。糖尿病組(n=20)、胰島素組(n=20)，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周、高糖高脂飼料喂養(yǎng)2周后，1%鏈脲佐菌素40 mg/kg腹腔內(nèi)注射(用0.1 mmol/L，pH值4.4枸櫞酸緩沖液配置)。3～7 d后針刺鼠尾取血查隨機(jī)末梢血糖，以≥16.7 mmol/L為入選標(biāo)準(zhǔn)。造模完成后對(duì)照組給予普通飼料飼養(yǎng)，糖尿病組、胰島素組繼續(xù)給予高糖高脂飼料飼養(yǎng)。對(duì)照組、糖尿病組不給予藥物干預(yù)，胰島素組予精蛋白鋅胰島素3～5 IU皮下注射1次/d，每周監(jiān)測(cè)2～3次血糖，根據(jù)血糖調(diào)整胰島素劑量，使隨機(jī)血糖控制在10 mmol/L以下，每周檢測(cè)體重。分別于成模后第4周、8周禁食10～12 h后測(cè)空腹末梢血糖。4%水合氯醛麻醉處死大鼠，打開胸腔，取出肺臟，10%中性甲醛固定，脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片，行HE染色，免疫組化檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinases，MMP －2)。

1.3 MMP－2免疫組化方法 切片常規(guī)脫蠟至水，PBS清洗3次，5 min/次，雙蒸水清洗3次，5 min/次，0.1 moL/L枸櫞酸緩沖液(pH值6.0)微波爐內(nèi)中火修復(fù)10 min，冷卻至室溫后滴加一抗(兔抗鼠1∶50)，濕盒4℃孵育18 h，0.01 mol/L PBS 清洗3次，5 min/次，滴加二抗(山羊抗兔)工作液，濕盒37℃溫箱孵育20 min，0.01 mol/L，PBS清洗3次，5 min/次，光鏡觀察下DAB顯色1～2 min，自來(lái)水充分沖洗終止顯色，蘇木精復(fù)染5 min，0.1%鹽酸酒精清洗15 s，梯度乙醇脫水，烘箱干燥，透明中性樹膠封固。以細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞核棕黃或黃色顆粒為表達(dá)陽(yáng)性。

1.4 HE染色 肺組織做4 μL連續(xù)切片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，3組間采用方差分析，不同時(shí)間采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 空腹血糖 第4周，對(duì)照組與糖尿病組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);對(duì)照組與胰島素比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);糖尿病組與胰島素組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。第8周，對(duì)照組與糖尿病組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);對(duì)照組與胰島素組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);糖尿病組與胰島素組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同組第8周與第4周比較，3組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 體重 第4周，對(duì)照組與糖尿病組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);對(duì)照組與胰島素比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);糖尿病組與胰島素組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。第8周，對(duì)照組與糖尿病組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);對(duì)照組與胰島素組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);糖尿病組與胰島素組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同組第8周與第4周比較，對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);糖尿病組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);胰島素組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見表1)。

表1 各組不同時(shí)間血糖、體重變化比較(s)

表1 各組不同時(shí)間血糖、體重變化比較(s)

注:與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較*P＜0.05，與同時(shí)間點(diǎn)糖尿病比較▲P＜0.05，與同組第4周比較△P＜0.05。

組 別 (n=10)空腹血糖(mmol/L)體重(g)對(duì) 照 組 4周5.3 ±2.3 355.2 ±26.5 8 周 4.6 ±0.8 406.2 ±37.2△糖尿病組 4周 29.3±5.5* 278.4±12.2*8 周 30.5 ±1.4* 263.2 ±15.2*胰島素組 4周 6.1±1.3▲ 344.1±12.1▲8 周 5.6 ±1.6▲ 421.1 ±23.3▲△

2.3 HE光鏡結(jié)果對(duì)照組 第4周大鼠肺泡形態(tài)完整，由單層肺泡上皮組成，相鄰肺泡之間有少量結(jié)締組織，可見散在的淋巴細(xì)胞，見少許散在中性粒細(xì)胞，第8周較第4周無(wú)明顯變化。糖尿病組:第4周大鼠肺泡形態(tài)欠完整，單層肺泡上皮構(gòu)成，基膜增多，可見中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，可見散在新生血管形成。第8周肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，多層肺泡上皮構(gòu)成，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)加重，炎癥嚴(yán)重區(qū)域可見少量散在纖維母細(xì)胞，成纖維細(xì)胞?？梢娦律苄纬?，血管管壁增厚，支氣管粘膜細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞胞核固縮。胰島素組:第4周肺泡形態(tài)基本完整，部分肺泡形態(tài)欠完整，均由單層肺泡上皮組成，相鄰肺泡之間有少量結(jié)締組織，可見淋巴細(xì)胞。第8周較第4周改變不明顯。

2.4 MMP－2免疫組化結(jié)果 各組大鼠肺泡上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿可見表達(dá)，少數(shù)支氣管上皮細(xì)胞胞核中見弱陽(yáng)性表達(dá)。第8周糖尿病大鼠除上述細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)增加外，還可見于肺泡間隔、肺泡腔內(nèi)的巨噬細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性。第4周，MMP－2染色光密度值3組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。第8周，對(duì)照組與糖尿病組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);對(duì)照組與胰島素組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);糖尿病組與胰島素組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同組第8周與第4周比較，對(duì)照組統(tǒng)計(jì)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);第8周糖尿病組大鼠陽(yáng)性染色光密度值高于同期對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);胰島素組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見表2、圖 1)。

表2 不同時(shí)間各組MMP－2陽(yáng)性染色光密度值(n=10)(s)

表2 不同時(shí)間各組MMP－2陽(yáng)性染色光密度值(n=10)(s)

注:與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較*P＜0.05，與同時(shí)間點(diǎn)糖尿病比較▲P＜0.05，與同組第4周比較△P＜0.05。

組 別 第4周 第8周0.224 ±0.012 0.243 ±0.016糖尿病組 0.214 ±0.254 0.277 ±0.344＊△胰島素組 0.239 ±0.156 0.245 ±0.221對(duì)照組▲

圖1 肺組織內(nèi)MMP－2表達(dá)(免疫組化×400)

3 討論

糖尿病主要引起血管病變，可導(dǎo)致神經(jīng)、心血管、視網(wǎng)膜、腎臟等器官、組織損害。肺臟血管分布豐富，大小血管均存在，在高血糖的影響下，可發(fā)生淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，長(zhǎng)時(shí)間后可能造成形態(tài)學(xué)改變、容易發(fā)生肺部感染，甚至導(dǎo)致肺纖維化，肺功能損害，出現(xiàn)通氣和彌散障礙。當(dāng)前，人們對(duì)糖尿病所導(dǎo)致的心肌病、腦血管病變、腎臟病變、神經(jīng)病變、眼底血管病變已有了廣泛的研究，但對(duì)糖尿病引起的肺損傷，特別是肺纖維化研究相對(duì)較少。

基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)是一類結(jié)構(gòu)同源的含鋅離子、活性鈣離子的內(nèi)肽酶的總稱，因含有金屬離子而得名［1］。它可降解和調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)中多種蛋白成分、使之保持動(dòng)態(tài)平衡。其主要來(lái)源于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞等。研究表明，在空腹血糖受損和IGT時(shí)即可有多種MMPs表達(dá)升高［2］。迄今發(fā)現(xiàn)28種基質(zhì)蛋白酶類。按照作用的底物又分為五類［3－4］。第一類:膠原酶(MMP－1、MMP－8、MMP－13、MMP－18)，第二類:明膠酶(MMP－2、MMP－9)，第三類:間質(zhì)溶素(MMP－3、MMP－10、MMP－11)，第四類:膜型 MMPs(MMP －14、MMP－15、MMP－16、MMP －17)，第五類:其他 MMPs，如明膠、FN、LN、內(nèi)皮粘連蛋白等。其中MMP－2也叫明膠酶A。MMP－2是所有MMP中分布最廣的。它主要降解明膠、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ膠原、纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)［5－6］，破壞基底膜，促進(jìn)與炎癥有關(guān)的細(xì)胞的遷移以及ECM重建。正常肺組織中，MMP－2呈弱性表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞惡變或組織受損時(shí)，常伴有MMP－2的升高，抑制MMP－2的活性可減輕肺損傷。

胰島素可以降低血糖，解除高糖毒性，減輕組織非酶促糖基化、山梨醇旁路活化及機(jī)體的氧化應(yīng)激，與血小板的胰島素受體結(jié)合，降低血栓素A2生成，有效地減少血小板聚集，改善組織血供狀態(tài)［7］。經(jīng)胰島素治療后血糖水平恢復(fù)恒定，肺通氣/灌注比(V/Q)和肺彌散(DLCO)改善。經(jīng)觀察，血糖經(jīng)胰島素治療基本正常者與未予胰島素治療血糖控制不理想者比較，后者同期肺功能損傷明顯［1］。除此之外，胰島素還有抑制前炎癥細(xì)胞因子、自由基的產(chǎn)生，增加抗炎細(xì)胞因子的非降糖作用，可引起外周血管擴(kuò)張和阻止細(xì)胞凋亡，防止組織缺血再灌注損害。胰島素還可擴(kuò)血管、改善血脂譜、促進(jìn)NO的分泌、降低PAI－1、抑制血小板聚集。降低MMP－2、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)等促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生因子在血中的濃度，有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。甘精胰島素在升高抗氧化酶的活性的同時(shí)有降低促氧化酶活性的作用，通過(guò)抑制機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而使機(jī)體功能免受氧化損傷。

從本研究肺組織HE染色圖片分析:糖尿病組與對(duì)照組相比，大鼠肺組織病理學(xué)改變表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞的大量浸潤(rùn)、新生血管形成、結(jié)締組織增生、肺泡結(jié)構(gòu)破壞。隨著病程進(jìn)展，肺損傷進(jìn)一步加重，表現(xiàn)為肺泡腔容積縮小，肺間質(zhì)明顯增生。而胰島素能顯著減輕糖尿病所致的肺組織結(jié)構(gòu)損害，并有效改善其組織病理學(xué)損傷的恢復(fù)。從肺組織內(nèi)MMP－2表達(dá)水平結(jié)果分析:在第4周，MMP－2的表達(dá)在各組之間無(wú)明顯差異。至第8周，糖尿病組肺組織MMP－2的表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，胰島素組肺組織MMP－2的表達(dá)較糖尿病組明顯下降。表明糖尿病時(shí)大鼠肺組織MMP－2的表達(dá)增高，而胰島素則抑制了MMP－2的表達(dá)。

本研究表明，糖尿病可導(dǎo)致肺臟損害。高血糖可導(dǎo)致肺組織MMP－2的表達(dá)增高，MMP－2的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致和(或)加重了肺組織內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺基質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞等一系列肺損傷表現(xiàn)，導(dǎo)致了糖尿病肺損傷的發(fā)生、發(fā)展。胰島素治療糖尿病，在降低血糖的同時(shí)，抑制了MMP－2的表達(dá)，減輕了糖尿病所致肺組織損傷。

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