常 亮， 劉曉志， 高 健

華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，抗體藥物研制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊050015

狂犬病毒糖蛋白及其中和性抗體研究進(jìn)展

常 亮， 劉曉志， 高 健

華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，抗體藥物研制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊050015

狂犬病是一種由狂犬病毒引發(fā)的高致命人獸共患傳染病，狂犬病毒糖蛋白作為唯一暴露于包膜外的病毒蛋白可有效誘生中和性抗體。本文介紹了狂犬病毒及其糖蛋白結(jié)構(gòu)與功能，全面綜述了狂犬病毒中和抗體研究進(jìn)展及其作用機(jī)制，為中和抗體的深入研究提供理論基礎(chǔ)和研發(fā)策略。

狂犬病毒；糖蛋白；中和抗體；作用機(jī)制

狂犬病是由狂犬病毒（rabies virus，RV）引發(fā)的一種高致命人獸共患傳染?。?］，呈全球性分布，目前全世界87個(gè)國(guó)家有狂犬病報(bào)道。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）統(tǒng)計(jì)，全球每年有5萬(wàn)多人死于狂犬病，約有1 000萬(wàn)人需要接受狂犬病毒的暴露后預(yù)防?？袢《局饕ㄟ^(guò)動(dòng)物咬傷傳播，在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量復(fù)制并破壞神經(jīng)元細(xì)胞，尚無(wú)有效的治療措施，WHO推薦采用疫苗結(jié)合抗病毒免疫球蛋白（rabies immune globulin，RIG）的方法進(jìn)行狂犬病暴露后預(yù)防［2，3］。目前應(yīng)用于暴露后預(yù)防的RIG為馬抗狂犬病毒免疫球蛋白（equine rabies immune globulin，ERIG）和人抗狂犬病毒免疫球蛋白（human rabies immune globulin，HRIG），前者副反應(yīng)嚴(yán)重，后者價(jià)格昂貴且有潛在的病原威脅。近年來(lái)隨著基因工程抗體技術(shù)的不斷發(fā)展，獲得了大量具有臨床應(yīng)用潛力的抗狂犬病毒單克隆抗體（Mabs），單抗特異性高、安全性好、生產(chǎn)成本低，大量實(shí)驗(yàn)表明單抗可作為RIG的替代品用于狂犬病暴露后預(yù)防。目前報(bào)道的抗狂犬病毒單克隆抗體除少部分識(shí)別核蛋白外［4］，大部分均針對(duì)病毒表面抗原——糖蛋白。本文主要針對(duì)狂犬病毒糖蛋白特異的中和性抗體最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 狂犬病毒概述

1．1 狂犬病毒的分類(lèi)地位與結(jié)構(gòu)特征

狂犬病毒（rabie virus，RABV）屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒屬（Lyssavirus）。彈狀病毒在自然界中分布廣泛，從動(dòng)物到植物均是彈狀病毒的感染宿主，家族成員超過(guò)150多種，除狂犬病毒外，還包括口炎病毒屬水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）、Novirhabdovirus病毒屬的病毒性出血性敗血病病毒（viral hemor?rhagic septicemia virus，VHSV）和傳染性造血組織壞死病毒（infectious hematopoietic necrosis virus），其中可感染哺乳動(dòng)物的主要是狂犬病毒屬和口炎病毒屬?？袢《境首訌棤罱Y(jié)構(gòu)（長(zhǎng)170～180 nm、直徑75～80 nm），由核衣殼和包膜組成，核衣殼包含與核蛋白N緊密結(jié)合的長(zhǎng)約12 kb的單股、不分節(jié)負(fù)鏈RNA基因組、RNA依賴的RNA聚合酶L和P蛋白，包膜為雙層脂膜，其上分布有400多個(gè)由糖蛋白G組成的三聚跨膜棘突，包膜與核衣殼間為病毒基質(zhì)蛋白M。大量試驗(yàn)證實(shí)，由唯一的狂犬病毒表面抗原糖蛋白決定病毒的免疫原性，能誘生中和抗體，保護(hù)動(dòng)物抵抗強(qiáng)毒株攻擊，是制備疫苗的重要成分［5］。核蛋白與磷蛋白可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，N主要誘導(dǎo)活化輔助T淋巴細(xì)胞（TH），而P可以有效地誘導(dǎo)TH細(xì)胞和Tc細(xì)胞，并表現(xiàn)相應(yīng)的免疫反應(yīng)性。對(duì)這些蛋白在不同毒株間的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，其氨基酸序列保守性順序?yàn)椋篘＞L＞M＞G＞P［6］。

1．2 狂犬病毒的分型

初期根據(jù)血清學(xué)分析和抗狂犬病毒單克隆抗體分析，將狂犬病毒屬分成4個(gè)血清型：血清Ⅰ型（狂犬病毒RABV）、血清Ⅱ型（拉各斯蝙蝠病毒LBV）、血清Ⅲ型（莫科拉病毒MOKV）和血清Ⅳ型（杜文海格病毒 DUVV）［7］。1993年，Bourhy等［8］根據(jù)核蛋白基因N端500個(gè)核苷酸的相似率，在原有分類(lèi)基礎(chǔ)上將狂犬病毒屬分為6個(gè)基因型，其中基因型1型～4型與血清型分型相同，增加了兩株歐洲蝙蝠狂犬病毒（European bat virus，EBL），分別為基因5型（EBL1）和基因6型（EBL2）［8］。1996年7月，澳大利亞發(fā)現(xiàn)果蝠體內(nèi)的澳大利亞蝙蝠狂犬病毒（Australia bat virus， ABL），被定為基因7型［9］?？袢《净蚍中脱芯窟M(jìn)一步將7個(gè)基因型分為2個(gè)進(jìn)化組［6，10］，基因型1、4、5、6和7為一組，基因型2和3為另一組，同組病毒的糖蛋白膜外區(qū)同源性至少為74%，且病毒保護(hù)抗體可與同組內(nèi)其他病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)，不同組病毒間膜外區(qū)同源性則低于64．5%，且不能產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)。最近幾年，不斷有新的病毒基因型被發(fā)現(xiàn)，從Eurasian bat中分離出了4種新的狂犬病毒：Aravan virus（ARAV）、Khujand virus（KHUV）、Irkut virus（IRKV）和West Caucasian bat virus（WCBV）［11］。在肯尼亞蝙蝠體內(nèi)分離出的Shimoni bat virus也是一種尚待分類(lèi)的新基因型［12］?；蚍中秃涂乖苑治鼍С謱⑵淞袨樾碌幕蛐汀４送?，幾種在蚊子上發(fā)現(xiàn)的病毒與Lyssavirus也有不少相似性［13］，但有待最后確認(rèn)。

2 狂犬糖蛋白結(jié)構(gòu)及功能

圖1 狂犬糖蛋白的結(jié)構(gòu)示意［18］Fig．1 Schematic diagram of domain and neutralizing epitope of glycoprotein［18］．

1．2 狂犬糖蛋白結(jié)構(gòu)及中和表位

狂犬病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein，RVG）是唯一暴露于病毒包膜外的病毒蛋白，屬于Ⅰ類(lèi)跨膜糖蛋白，成熟糖蛋白以三聚棘突（長(zhǎng)8．3 nm）形式位于狂犬病毒雙層脂膜上，在病毒的細(xì)胞粘附、膜融合及軸漿運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)揮重要作用。成熟糖蛋白由505個(gè)氨基酸組成，分成3個(gè)區(qū)域（圖1）：膜外區(qū)1～439位氨基酸，參與識(shí)別受體與膜融合反應(yīng)，其空間結(jié)構(gòu)通過(guò)3對(duì)二硫鍵（C35?C207、C169?C189、C228?C283）維持；跨膜區(qū)440～461位氨基酸，由22個(gè)氨基酸組成連續(xù)性疏水區(qū)，與糖蛋白的病毒脂膜固定有關(guān)；膜內(nèi)區(qū)462～505位氨基酸，位于病毒包膜內(nèi)表面，提供基質(zhì)蛋白和核蛋白作用位點(diǎn)，對(duì)三聚棘突的穩(wěn)定性具有一定影響。

抗體逃逸株點(diǎn)突變分析結(jié)果表明，糖蛋白上至少存在3個(gè)主要中和抗體結(jié)合位點(diǎn)：抗原位點(diǎn)Ⅰ～Ⅲ，此外，還有一些次要線性表位［14～17］。其中抗原位點(diǎn)Ⅰ位于218～240位氨基酸區(qū)域，是一個(gè)次要線性中和表位，其最小結(jié)合區(qū)為KLCGVL（226～231位），核心殘基為K?CGV?［18］。Ⅱ號(hào)位點(diǎn)是由第34～42位和第198～200位氨基酸兩個(gè)位點(diǎn)通過(guò)二硫鍵C35?C207形成的一個(gè)保守性較高的空間表位［19］，其中34～42位、147位、184位和198～200位氨基酸至關(guān)重要［20］。Ⅲ號(hào)位點(diǎn)位于330～357位氨基酸，也是一個(gè)空間表位，其中333～338位氨基酸區(qū)段是中和抗體主要結(jié)合部位，位于342～343位的a表位是次要的中和位點(diǎn)［14］，第330位、333位、336位及338位氨基酸是關(guān)鍵殘基［21］。Ⅱ號(hào)和Ⅲ號(hào)抗原位點(diǎn)是主要病毒中和表位，兩位點(diǎn)在空間上十分接近，其中一些關(guān)鍵殘基突變可對(duì)病毒的毒力、宿主范圍或傳播速度產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糖蛋白上260～267位（LHDFRSDE）為一線性中和表位［16］，單獨(dú)或與T細(xì)胞表位聯(lián)用可在小鼠體內(nèi)誘生抗狂犬抗體，有效抵抗病毒攻擊。

近年來(lái)隨著分子生物學(xué)及計(jì)算生物學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了一些新的糖蛋白中和表位。Yang等［22］利用犬抗狂犬病毒免疫球蛋白對(duì)隨機(jī)12肽庫(kù)進(jìn)行篩選，經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)獲得的球蛋白特異識(shí)別肽段與已報(bào)道的狂犬糖蛋白及核蛋白中和表位高度匹配，其中30%的肽段與Ⅱ號(hào)、Ⅲ號(hào)表位重疊，此外還發(fā)現(xiàn)一個(gè)之前沒(méi)有報(bào)道過(guò)的糖蛋白中和表位基序RYDD?W?T（126～141位氨基酸），該研究表明對(duì)于狂犬病毒中和表位仍有繼續(xù)研究的空間。

2．2 糖蛋白介導(dǎo)的受體識(shí)別

RVG在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的過(guò)程中起主要作用，包括介導(dǎo)病毒與細(xì)胞受體的結(jié)合、病毒的內(nèi)吞及病毒質(zhì)膜與內(nèi)吞體膜的融合等。一些膜分子被證實(shí)參與糖蛋白結(jié)合，主要有煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptor，NAchR）、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體（p75NTR）和神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（NCAM）等，此外還有一些磷脂及神經(jīng)節(jié)苷脂也被發(fā)現(xiàn)具有狂犬病毒受體的功能?？袢《臼荏w由于種類(lèi)多樣目前仍存在爭(zhēng)議，推測(cè)其受體多樣性的可能原因是病毒在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)感染、轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中不同階段需要不同的受體發(fā)揮作用。

2．2．1 煙堿型乙酰膽堿受體NachR NAchR是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的可能的狂犬病毒受體［23］，主要分布于突觸后肌細(xì)胞膜?？袢《咎堑鞍缀蜕叨炯緲由窠?jīng)毒蛋白序列同源性分析以及兩種蛋白合成肽與NAchR結(jié)合活性試驗(yàn)表明，NAchR主要識(shí)別糖蛋白173～204位氨基酸區(qū)域［24］。然而有些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺乏乙酰膽堿受體的細(xì)胞系仍可被狂犬病毒感染，另外預(yù)先經(jīng)蛇毒處理也不能降低這些細(xì)胞被感染的比例［25］，表明病毒的侵入過(guò)程涉及其他受體分子。

2．2．2 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體p75NTR p75NTR是1型、6型狂犬病毒受體［26］，參與病毒的內(nèi)吞及逆軸漿運(yùn)輸。轉(zhuǎn)染神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體可使狂犬病毒耐受細(xì)胞株BSR重新變成病毒易感型。

2．2．3 神經(jīng)細(xì)胞黏附分子NCAM 通過(guò)不同細(xì)胞株的比較觀測(cè)確定了另一種候選受體——神經(jīng)細(xì)胞黏附分子 NCAM［27］。在病毒感染過(guò)程中，NCAM聚集于神經(jīng)肌肉接頭（NMJ）的突觸前膜，與RV在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。細(xì)胞的病毒易感性由NCAM分子決定，阻斷NCAM可降低病毒感染比例，轉(zhuǎn)染NCAM可提高細(xì)胞的病毒易感性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比野生型小鼠，缺乏NCAM的小鼠受病毒感染后的死亡進(jìn)程明顯滯后［27］。

2．3 糖蛋白介導(dǎo)的膜融合

RVG介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的膜融合過(guò)程。病毒融合蛋白根據(jù)分子結(jié)構(gòu)可分為三類(lèi)。Ⅰ類(lèi)融合蛋白包括正粘病毒、副粘病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒及絲狀病毒的糖蛋白等。流感病毒血凝素為典型的Ⅰ類(lèi)融合蛋白，其特征在于前體蛋白剪切后形成的三聚棘突結(jié)構(gòu)及發(fā)夾樣后融合構(gòu)象［28］。Ⅱ類(lèi)融合蛋白（包括黃病毒屬的E蛋白和甲病毒屬的E1蛋白等）通常以二聚體形式存在，不會(huì)被蛋白酶剪切，而與之連接的其他病毒膜蛋白在融合過(guò)程中往往會(huì)被剪切［29］。這兩類(lèi)蛋白在融合機(jī)制上具有共同點(diǎn)，即體內(nèi)酸性環(huán)境可誘導(dǎo)包膜二聚體解聚重排形成三聚體，融合肽位于多聚體分子的一端，盡管結(jié)構(gòu)不同，但這兩類(lèi)融合蛋白在此過(guò)程中均傾向于形成一個(gè)較為穩(wěn)定的后融合態(tài)，向后融合態(tài)不可逆的構(gòu)象轉(zhuǎn)變提供了融合過(guò)程所需的能量。隸屬于彈狀病毒科的狂犬病毒糖蛋白屬于Ⅲ類(lèi)融合蛋白。對(duì)水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）糖蛋白晶體結(jié)構(gòu)的解析揭示了彈狀病毒糖蛋白的融合機(jī)制與前兩者均不相同［30］。電鏡及單克隆抗體、酶切實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，在低pH誘導(dǎo)的膜融合過(guò)程中，糖蛋白存在三種不同的pH依賴的構(gòu)象［31］：中性環(huán)境下為天然構(gòu)象（native，天然態(tài)），pH 6．7以下為活化構(gòu)象（activated，活化態(tài)），pH 6．4以下為非活化構(gòu)象（inactive，失活態(tài)）（圖2）。電鏡研究結(jié)果表明，G蛋白處于失活態(tài)的時(shí)間更長(zhǎng)，且失活態(tài)G蛋白比天然態(tài)G蛋白的蛋白酶敏感性更高，pH誘導(dǎo)的變構(gòu)作用破壞了天然構(gòu)象G蛋白上的幾個(gè)主要的構(gòu)象表位（如Ⅱ號(hào)表位），導(dǎo)致非活化構(gòu)象糖蛋白與天然態(tài)糖蛋白的形態(tài)和免疫原性均有較大的差異；活化態(tài)G蛋白疏水性較強(qiáng)，可觸發(fā)病毒聚集，與天然態(tài)在形態(tài)和免疫原性上均十分相似，其穩(wěn)定性依賴于pH和溫度［32］。許多試驗(yàn)表明G蛋白的不同構(gòu)象之間存在一個(gè)pH依賴的動(dòng)態(tài)平衡。特異識(shí)別失活態(tài)的單克隆抗體在中性條件下長(zhǎng)時(shí)間孵育也可與病毒顆粒結(jié)合，使該平衡向失活態(tài)偏移［33］。同樣識(shí)別天然態(tài)的單克隆抗體也可以使膜融合最適pH條件下的平衡向天然態(tài)發(fā)生移動(dòng)［34］。電鏡結(jié)果顯示在37℃、pH＞6．4的環(huán)境中孵育2 h的病毒顆粒表面同時(shí)存在天然態(tài)和失活態(tài)G蛋白，在pH達(dá)到6．7時(shí)兩種狀態(tài)的G蛋白數(shù)量相當(dāng)［32］。G蛋白這種結(jié)構(gòu)變化的可逆性對(duì)于其在分泌系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)運(yùn)十分必要。高爾基體中pH接近6．2，后高爾基體中pH更低，這意味著G蛋白在分泌過(guò)程中無(wú)法處于天然態(tài)，實(shí)驗(yàn)也表明在分泌小泡中存在失活態(tài)G蛋白，這可以避免不必要的融合且可以保證其在質(zhì)膜表面重折疊形成天然態(tài)。由于結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的可逆性，此過(guò)程產(chǎn)生的能量十分有限，破壞靶膜與形成初始融合孔所需的能量需要至少13～19個(gè)G蛋白三聚體的形成來(lái)提供［34］。

3 狂犬病毒中和性抗體研究進(jìn)展

圖2 狂犬糖蛋白依賴pH的構(gòu)象變化［31］Fig．2 pH?dependent conformation change of rabies glycoprotein［31］．

3．1 糖蛋白特異的人源中和抗體研究

1978年，Wiktor等［35］應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備了抗狂犬病毒單克隆抗體，并證明其能夠保護(hù)動(dòng)物抵抗致死性狂犬病毒的攻擊，開(kāi)啟了抗狂犬病毒抗體研究的大門(mén)。隨著分子免疫學(xué)和抗體工程技術(shù)的發(fā)展，特別是噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的出現(xiàn)，使大量獲得人源基因工程抗體成為可能，克服了人抗鼠抗體反應(yīng)（human anti?mouse antibody，HAMA）。Dietzschold等［36］獲得了9種能夠識(shí)別狂犬病毒G蛋白、N蛋白和M蛋白的單克隆抗體，但其中針對(duì)G蛋白的Mab57具有中和多種狂犬病毒的能力。隨后 Prosniak等［37］和 Jones等［38］將 Mab57進(jìn)行了一系列改造，獲得的抗體CR57識(shí)別G蛋白Ⅰ號(hào)表位的KLCGVL位點(diǎn)（1型狂犬病毒中保守性高達(dá)99%），可保護(hù)多種毒株的攻擊。Kramer等［39］構(gòu)建了人源抗狂犬病毒單鏈?zhǔn)删w抗體庫(kù)，篩選到一株針對(duì)狂犬病毒糖蛋白Ⅲ號(hào)表位的單克隆抗體CR4098，該抗體逃逸株的Ⅲ號(hào)表位存在N336D突變，該突變?cè)?型狂犬病毒的發(fā)生率為4%。Goudsmit等［40］將 CR57和CR4098聯(lián)合使用，可中和26種典型的街毒株，再與疫苗聯(lián)用可有效保護(hù)暴露24 h后的敘利亞倉(cāng)鼠，臨床結(jié)果表明兩者聯(lián)用可作為安全有效的RIG替代品用于暴露后預(yù)防［41］。Sloan等［42］利用攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠獲得了另一株針對(duì)狂犬病毒糖蛋白Ⅲ號(hào)表位的人源單抗17C7。Houimel和Dellagi［43］基于抗狂犬人源Fab噬菌體庫(kù)，篩選到6株Fab抗體，其中3株特異識(shí)別Ⅲ號(hào)表位并顯示了一定的CVS?11中和能力。Wang等［44］報(bào)道了另一株針對(duì)糖蛋白Ⅲ號(hào)和a表位的中和抗體，該抗體結(jié)合336和346位點(diǎn)，該表位雖然保守性較差，但突變株中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1型狂犬病毒中336和346位點(diǎn)存在的各種氨基酸組合均可被該抗體有效識(shí)別。

我國(guó)在狂犬單抗領(lǐng)域的研究也十分深入。趙小玲等［45］基于抗狂犬病毒人源單鏈抗體核糖體庫(kù)，篩選到幾株針對(duì)狂犬糖蛋白的單鏈抗體。華北制藥集團(tuán)研發(fā)的人源狂犬抗體NM57已進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)階段［46］，并與中國(guó)疾病控制中心病毒所合作開(kāi)發(fā)了針對(duì)保守性更高的Ⅱ號(hào)表位的中和抗體［47］。Sun等［47］基于高滴度狂犬病毒抗體的疫苗注射者外周血淋巴細(xì)胞構(gòu)建噬菌體人源抗體庫(kù)，成功篩選到11株針對(duì)狂犬病毒顆粒aG和CTN株的Fab抗體，利用昆蟲(chóng)／桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)出其中5株全抗，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這些抗體具有明顯的體外病毒中和活性，所識(shí)別表位相互重疊且均針對(duì)狂犬病毒糖蛋白Ⅱ號(hào)表位（在狂犬病毒屬1型進(jìn)化亞組病毒中高度保守），該表位與某些細(xì)胞受體識(shí)別表位有部分重疊，提示中和機(jī)制可能與阻礙病毒的細(xì)胞黏附有關(guān)。

3．2 抗體的病毒中和機(jī)制研究

盡管目前對(duì)于狂犬病毒致病機(jī)制及其預(yù)防已進(jìn)行了深入研究，且篩選到大量具有臨床應(yīng)用前景的抗體，然而由于宿主對(duì)狂犬病毒攻擊的抵抗依賴于包括中和抗體、抗原遞呈細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和干擾素等免疫系統(tǒng)各組成部分之間復(fù)雜的相互作用，這種相互作用至今仍無(wú)法完全闡明，所以對(duì)抗體中和機(jī)制的研究仍相對(duì)滯后，并沒(méi)有能夠從分子水平上將中和表位與病毒致病機(jī)制聯(lián)系起來(lái)?？共《究贵w的可能作用機(jī)制主要有：①阻斷病毒糖蛋白與靶細(xì)胞受體或胞膜間的相互作用；②介導(dǎo)病毒交聯(lián)以減少感染“單位”數(shù)量；③介導(dǎo)天然免疫系統(tǒng)對(duì)病毒顆粒的攻擊；④介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒作用；⑤活化補(bǔ)體系統(tǒng)。

Dietzschold等［48］早在1987年就對(duì)狂犬病毒特異抗體作用機(jī)制進(jìn)行過(guò)探索，研究發(fā)現(xiàn)除Fc依賴的病毒清除機(jī)制外，抗體的中和機(jī)制與抗體類(lèi)型及識(shí)別表位密切相關(guān)。電鏡試驗(yàn)結(jié)果表明中和狀態(tài)下，3個(gè)棘突平均可結(jié)合1～2個(gè)IgG分子，一個(gè)IgM分子則可結(jié)合9到10個(gè)棘突［49］。Burton等［50］發(fā)現(xiàn)抗病毒抗體的相似作用機(jī)制，達(dá)到63%中和率所需IgG分子數(shù)N與病毒顆粒表面積A呈線性關(guān)系（N＝0．0033×A），應(yīng)用該公式推算中和一個(gè)狂犬病毒顆粒需225個(gè)IgG抗體分子。Irie等［51］全面比較了兩株糖蛋白特異的單克隆抗體＃1?46?12和＃7?1?9的病毒中和能力的差異，發(fā)現(xiàn)兩株抗體的病毒結(jié)合能力相近，親和力均為1．7×10-10mol／L左右，平衡態(tài)單顆粒結(jié)合數(shù)分別為707和770，大概為病毒表面抗原數(shù)量（約1 350個(gè)G蛋白［52］，即約445個(gè)棘突結(jié)構(gòu)）的一半?？贵w中和活性分析結(jié)果表明，兩株抗體均可通過(guò)阻斷病毒的細(xì)胞黏附來(lái)實(shí)現(xiàn)中和作用，而兩者中和滴度差別顯著，前者高于后者200多倍，中和所需最少抗體數(shù)目也有較大差別（＃1?46?12數(shù)量≤20，而＃7?1?9數(shù)量≥250）［51］?？贵w逃逸株分析結(jié)果表明，兩株抗體識(shí)別表位不同，＃1?46?12識(shí)別一個(gè)高度保守的空間表位，而＃7?1?9識(shí)別G蛋白中間區(qū)域的一個(gè)線性表位，F(xiàn)263L會(huì)導(dǎo)致結(jié)合活性的完全喪失［51］。綜合最小抗體結(jié)合數(shù)推測(cè)：超過(guò)250個(gè)＃7?1?9分子可以達(dá)到對(duì)三聚棘突60%的覆蓋率，可能是通過(guò)位阻效應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒粘附的阻斷作用；而僅需不到20個(gè)＃1?46?12分子即可實(shí)現(xiàn)病毒的有效中和，說(shuō)明兩者的中和機(jī)制存在較大差異。對(duì)＃1?46?12作用機(jī)制的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該抗體逃逸株可分為兩類(lèi)［53］：一類(lèi)識(shí)別表位存在T36P突變（R?31株），無(wú)抗體結(jié)合活性；另一類(lèi)表位發(fā)生S39T突變（R?61株），具有正常的抗體結(jié)合活性，與野生型G蛋白不同的是其N(xiāo)37位點(diǎn)發(fā)生額外的糖基化。在突變株中引入少量野生型G蛋白后，R?61株重新恢復(fù)了對(duì)抗體的敏感性，而R?31仍對(duì)＃1?46?12具有耐受性［54］，這一結(jié)果表明＃1?46?12并不是通過(guò)遮蔽G蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)來(lái)直接阻斷病毒粘附，而可能通過(guò)結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)糖蛋白發(fā)生變構(gòu)使之喪失細(xì)胞受體結(jié)合能力，這種誘變作用具有抗體結(jié)合活性依賴的多米諾效應(yīng)，N37位點(diǎn)上的寡糖鏈可以一定程度上抑制＃1?46?12的初始誘變但無(wú)法抑制多米諾級(jí)聯(lián)的變構(gòu)過(guò)程。該研究表明狂犬中和機(jī)制十分復(fù)雜，涉及糖基化、變構(gòu)等分子水平層面的過(guò)程，對(duì)抗體作用機(jī)制的闡明需要進(jìn)一步分子水平的糖蛋白結(jié)構(gòu)研究。

4 展望

盡管?chē)?guó)內(nèi)外對(duì)于狂犬病毒，尤其是其表面抗原——狂犬病毒糖蛋白及其中和表位開(kāi)展了十分廣泛的研究，篩選獲得了大量具有臨床應(yīng)用前景的治療型抗體，但對(duì)這些抗體的中和機(jī)制的研究仍相對(duì)滯后，無(wú)法闡明中和抗體的抗病毒機(jī)制。對(duì)狂犬病毒糖蛋白及其中和性抗體結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究有利于從分子水平上闡明中和抗體對(duì)病毒致病過(guò)程的抑制機(jī)制，對(duì)于抗病毒抗體的研究具有重要意義，同時(shí)有利于闡明病毒表面抗原與病毒致病機(jī)制的相關(guān)性，對(duì)于病毒中和表位的研究具有指導(dǎo)意義。

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Progress in Rabies Virus Glycoprotein and Neutralizing Antibody

CHANG Liang，LIU Xiao?zhi，GAO Jian
State Key Laboratory of Antibody Research and Development，New Drug Research and Development Company Ltd．，North China Pharmaceutical Corporation，Shijiazhuang 050051，China

Rabies is a fatal zoonosis caused by rabies virus（RV）．Rabies virus glycoprotein（RVG），the unique viral protein exposed on the surface of viral envelope，can induce the production of rabies neutralizing antibodies．This review focuses on recent advances in rabies virus，the structure and function of glycoprotein，progress of neutralizing antibodies and their action mechanism，which can provide theoretical foundations and development strategies for further study of neutralizing antibodies．

rabies virus；glycoprotein；neutralizing antibody；mechanism

10．3969／j．issn．2095?2341．2013．05．02

2013?05?02；接受日期：2013?06?14

國(guó)家975項(xiàng)目“生物活性分子結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系研究”（2012CB724500）資助。

常 亮，工程師，博士，研究方向?yàn)樯c分子生物學(xué)。E?mail：changliang1981＠gmail．com