張曉華，肖作為，陸廣琴，焦志莎，黃紹國

（湖南永州市中心醫(yī)院，湖南 永州 425006）

鹽酸林可霉素又名潔霉素（Lincomycin Hydrochloride）為白色結(jié)晶性粉末；有微臭或特殊臭；味苦。在水或甲醇中易溶，在乙醇中略溶[1]?？芍委煾鞣N感染，屬抑菌劑，是窄譜抗生素，作用機(jī)制與紅霉素相似，主要抑制細(xì)菌細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，對革蘭陽性球菌有較好作用，特別對厭氧菌、金葡菌及肺炎球菌高效[2]。在人體內(nèi)分布廣，可進(jìn)入骨髓和骨組織，臨床上廣泛用于呼吸系統(tǒng)、骨髓炎及軟組織感染等病癥的治療，尤其適用于對青霉素過敏的患者[3]。

林可霉素的生物合成及代謝調(diào)節(jié)機(jī)制是極為復(fù)雜交錯(cuò)的生理生化現(xiàn)象[4]，工業(yè)化生產(chǎn)主要是通過林可霉素產(chǎn)生菌好氧發(fā)酵制取[5]。本文則通過正交試驗(yàn)，分析鹽酸林可霉素產(chǎn)生菌擴(kuò)大培養(yǎng)的最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 主要原料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料 菌種LA02，由南陽化工廠中心實(shí)驗(yàn)室提供；玉米漿，由華北制藥康欣有限公司提供；自制豆餅粉，過80目篩。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 玉米淀粉，由河南巨龍淀粉實(shí)業(yè)有限公司提供；葡萄糖，由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供；硫酸銨，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供；碳酸鈣，為南陽市蒲山化工廠提供；瓊脂，北京奧博星有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

托盤天平，深圳市瑞鑫達(dá)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)搖瓶機(jī)XDW 50/50，樂山三九長征藥業(yè)股份有限公司；高壓滅菌鍋F01-01-181，上海坤肯生物化工有限公司；凈化臺（F01-01-141）SWCJ-1CU，深圳市瑞鑫達(dá)儀器有限公司；恒溫恒濕機(jī)HS-125DBD系列，無錫海力斯環(huán)境設(shè)備有限公司；美德時(shí)溫濕度表：TH602F，加升環(huán)球?qū)崢I(yè)有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱-DHG-9070A，杭州匯爾儀器有限公司；普通溫度計(jì)；容聲電冰箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 斜面培養(yǎng)基制備流程 投料→配置斜面培養(yǎng)基→滅菌→接種→培養(yǎng)

1.3.2 母瓶培養(yǎng)基制作流程 配料→配置母瓶培養(yǎng)基→滅菌→接種→培養(yǎng)→并瓶

1.3.3 母瓶培養(yǎng)基PH調(diào)控 母瓶培養(yǎng)基的PH是通過碳酸鈣和NaOH控制的，將按配方稱量好的各營養(yǎng)組分用飲用水進(jìn)行糊化，微沸調(diào)堿至PH6.60，加入已稱量好的16 g碳酸鈣進(jìn)行高壓滅菌。檢測消后各項(xiàng)指標(biāo)[6]。

接種后，將本批母瓶置于搖瓶間發(fā)酵培養(yǎng)兩天后，與母移各檢測指標(biāo)進(jìn)行對比，并通過顯微鏡觀察菌絲生長狀況，以菌絲伸展年輕有力為宜[7]。

1.3.4 母瓶發(fā)酵環(huán)境的單因子試驗(yàn)

（1）搖瓶間溫度控制試驗(yàn)：將搖瓶間的溫度分別調(diào)至25℃，30 ℃，35 ℃。搖瓶發(fā)酵后對母移指標(biāo)進(jìn)行比較，觀察菌絲生長狀況，確定最佳培養(yǎng)溫度。

（2）搖瓶間濕度控制試驗(yàn)：將搖瓶間的濕度分別調(diào)至40%，45 %，50 %。搖瓶發(fā)酵后對母移指標(biāo)進(jìn)行比較，觀察菌絲生長狀況，確定最佳搖瓶間濕度。

（3）搖床旋轉(zhuǎn)速度調(diào)控試驗(yàn)：將搖床的轉(zhuǎn)速分別調(diào)至180 r/min，220 r/min，260 r/min。搖瓶發(fā)酵后對母移指標(biāo)進(jìn)行比較，觀察菌絲生長狀況，確定最佳轉(zhuǎn)速。

（4）搖瓶時(shí)間的確定：接種后的母瓶置于搖瓶間44 h，48 h，52 h分別摘取3支母瓶進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測，同時(shí)進(jìn)行鏡檢，觀察菌絲生長狀況，確定最佳搖瓶時(shí)間。見表1。

1.3.5 種子發(fā)酵培養(yǎng)環(huán)境的工藝確定

表1 因素水平表

表2 L9(3)4正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果檢測方法

發(fā)酵效價(jià)：藤黃八疊球菌28001為檢定菌的生物效價(jià)測定[8]。

氨氮：甲醛測定法[9]。

還原糖：斐林氏滴定法[10]。

菌絲濃度：準(zhǔn)確吸取10 mL培養(yǎng)液，3000 r/min，離心5 min，測上清液體積V，根據(jù)（10-V）/10×100%求得菌絲濃度[12]。

菌絲形態(tài)：顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶間溫度對發(fā)酵種子菌絲生長的影響

母瓶培養(yǎng)基接種后置于搖瓶間的培養(yǎng)溫度對種子生長狀況有顯著影響。溫度過低或過高，都不利于種子發(fā)酵，表現(xiàn)在培養(yǎng)基中營養(yǎng)素的變化及菌絲的伸展形態(tài)上。把接種后的母瓶置于不同溫度的培養(yǎng)間，48 h后從搖床上摘下種子進(jìn)行各指標(biāo)檢驗(yàn)，見圖1。

不同溫度控制下菌絲生長狀況鏡檢菌絲描述如下：25 ℃溫度控制下菌絲黃褐色，著色藍(lán)，顆粒稍細(xì)，掛瓶度一般，部分實(shí)團(tuán)，顆粒不明顯，偏年輕。30 ℃溫度控制下菌絲著色深藍(lán)，顆粒細(xì)，掛瓶度高，稍粘稠，實(shí)團(tuán)粗壯，邊緣伸展有力。35℃溫度控制下黃褐色，菌絲大團(tuán)網(wǎng)，邊緣束狀散開，體不實(shí)，多空泡，模糊，菌絲偏老。

結(jié)果表明，接種后搖瓶發(fā)酵最適溫度為30 ℃。當(dāng)溫度較低時(shí)，種子發(fā)酵過程生長緩慢，菌絲偏年輕；總糖及氨基氮利用率不高；沒有達(dá)到理想狀況。而溫度較高時(shí)，種子發(fā)酵速度快，營養(yǎng)成分消耗快，影響種子中后期發(fā)酵，菌絲較老，伸展力度不高。

2.2 搖瓶間濕度對發(fā)酵種子菌絲生長的影響

母瓶培養(yǎng)基接種后置于搖瓶間的培養(yǎng)濕度對種子生長狀況也有較大影響。濕度過低或過高，都會(huì)影響培養(yǎng)基中水分蒸發(fā)，進(jìn)而影響營養(yǎng)成分的含水量，不利于種子發(fā)酵，表現(xiàn)在培養(yǎng)基中營養(yǎng)素的變化及菌絲的伸展形態(tài)上。因此把接種后的母瓶置于不同溫度的培養(yǎng)間，48 h后從搖床上摘下種子進(jìn)行各指標(biāo)檢驗(yàn)，結(jié)果繪成柱狀圖，見圖2。

不同濕度控制下觀察菌絲生長狀況，鏡檢拍照形態(tài)描述如下：40 %濕度控制下菌絲顆粒稍細(xì)，呈現(xiàn)黃褐色，著色藍(lán)，掛瓶度一般，部分實(shí)團(tuán)，邊緣伸展粗壯。45 %濕度控制下菌絲顆粒細(xì)，掛瓶度高，稍粘稠，粗壯，著色深藍(lán)，實(shí)團(tuán)，邊緣伸展有力。50%濕度控制下，菌絲黃褐色，菌絲大團(tuán)網(wǎng)，邊緣束狀散開，掛瓶度適中，著色藍(lán)，邊緣伸展。結(jié)果顯示，濕度在45%左右對菌絲生長無明顯影響。種子消耗培養(yǎng)基中的碳源和氮源進(jìn)行發(fā)酵，菌絲伸展粗壯有力。搖瓶間的濕度應(yīng)控制在45%～48%。

2.3 搖床轉(zhuǎn)速對發(fā)酵種子菌絲生長的影響

搖床轉(zhuǎn)速影響到培養(yǎng)基中的空氣流動(dòng)，則會(huì)影響母瓶中含氧量，鹽酸林可霉素的生產(chǎn)是通過林可霉素產(chǎn)生菌經(jīng)好氧發(fā)酵生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)控制搖床轉(zhuǎn)速分別為180 r/min，220 r/min，260 r/min，48 h后檢測到母移指標(biāo)，對比結(jié)果見圖3。

不同轉(zhuǎn)速控制下菌絲生長狀況鏡檢結(jié)果描述如下：搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，菌絲顆粒稍細(xì)，掛瓶度較低，黃褐色，著色藍(lán)，部分實(shí)團(tuán)有空泡，邊緣伸展纖弱。控制轉(zhuǎn)速為220 r/min時(shí)，菌絲顆粒細(xì)掛瓶度高，稍粘稠，著色深藍(lán)，實(shí)團(tuán)，邊緣伸展粗壯有力。轉(zhuǎn)速為260 r/min時(shí)，菌絲黃褐色，菌絲大團(tuán)網(wǎng)，邊緣束狀散開，掛瓶度適中，著色藍(lán)，邊緣伸展粗壯。

由此可知，轉(zhuǎn)速過高，氧氣含量高時(shí)，種子發(fā)酵速度快，菌絲生長有偏老跡象；而轉(zhuǎn)速較慢時(shí)，含氧量低不利于發(fā)酵過程的進(jìn)行。因而，搖床轉(zhuǎn)速控制在220 r/min為宜。

2.4 培養(yǎng)時(shí)間對發(fā)酵種子菌絲生長的影響

為研究不同的發(fā)酵時(shí)間對產(chǎn)品品質(zhì)的影響，本試驗(yàn)將接種后的母瓶培養(yǎng)基在30 ℃的溫度下?lián)u瓶培養(yǎng)44 h、48 h、52 h，定時(shí)摘取母瓶進(jìn)行指標(biāo)檢測，將結(jié)果繪圖，見圖4。

不同培養(yǎng)時(shí)間條件下菌絲生長狀況鏡檢描述如下：培養(yǎng)44 h后，鏡檢菌絲顆粒稍細(xì)，掛瓶度較低，黃褐色，著色藍(lán)，部分成實(shí)團(tuán)，邊緣伸展有力。48 h時(shí)，菌絲顆粒細(xì)，掛瓶度高，稍粘稠，著色深藍(lán)，實(shí)團(tuán)，邊緣伸展粗壯有力。52 h時(shí)，菌絲黃褐色，菌絲大團(tuán)網(wǎng)，邊緣束狀散開，掛瓶度適中，著色蘭，邊緣伸展粗壯，菌絲偏老。從表中檢測結(jié)果可比較得出，搖瓶時(shí)間為48 h較為合適，時(shí)間過長，菌絲生長較老，不利于接入小罐繼續(xù)生長。

2.5 種子發(fā)酵培養(yǎng)環(huán)境條件正交試驗(yàn)分析結(jié)果

圖1 搖瓶間溫度對菌絲生長的影響

圖2 搖瓶間濕度對菌絲生長的影響

圖3 搖床轉(zhuǎn)速對菌絲生長的影響

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對菌絲生長的影響

種子接正常量母瓶，按不同工藝培養(yǎng)后從搖床上取下檢測平均效價(jià)和菌絲濃度。見表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表中的極差分析可知，對林可霉素產(chǎn)生菌LA02發(fā)酵水平的影響主次順序?yàn)锽＞D＞A＞C，其中B、A、D對發(fā)酵水平具有顯著性影響，C無顯著性影響。經(jīng)正交方差分析得出最佳配比A2B2C3D1。

3 結(jié)論

對九組實(shí)驗(yàn)分別取樣涂片，鏡檢結(jié)果見表4。

表4 正交試驗(yàn)下的鏡檢結(jié)果

鏡檢觀察結(jié)果與正交試驗(yàn)基本一致，從而可確定母瓶培養(yǎng)基最佳配比方案為：搖瓶間溫度30 ℃，濕度45%，搖床轉(zhuǎn)速220 r/min，培養(yǎng)48 h。此時(shí)的平均效價(jià)最高，菌絲生長狀態(tài)較為理想，與直觀最佳配比A2B3C3D1基本一致。種子接入小罐后有更頑強(qiáng)的生命力，產(chǎn)量更高。

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