李艷冬，周 剛，肖曉丹，劉禮丹，崔國(guó)霞

Sport College，Hunan University，Changsha Hunan，410082

運(yùn)動(dòng)性疲勞研究至今已有一百多年的歷史，大量研究結(jié)果表明：不同強(qiáng)度、不同時(shí)間、不同運(yùn)動(dòng)方式產(chǎn)生的運(yùn)動(dòng)性疲勞機(jī)制是完全不同的。1978年迪拉德（Dillard）首次將自由基理論引入運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。近30多年來(lái)的文獻(xiàn)顯示：急性運(yùn)動(dòng)和力竭運(yùn)動(dòng)都可以導(dǎo)致內(nèi)源性氧自由基生成增多，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)、構(gòu)成了對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的損害，與運(yùn)動(dòng)性疲勞的關(guān)系密切。運(yùn)動(dòng)中產(chǎn)生的主要自由基是超氧陰離子（superoxide radical，O2－。），它是機(jī)體其他活性氧的主要來(lái)源。在病理情況下，O2－?？膳cNO結(jié)合進(jìn)一步生ONOO－。NO過(guò)多會(huì)導(dǎo)致心血管損害，并伴有氧自由基和ONOO－形成［1］。研究認(rèn)為，ONOO－是細(xì)胞因子誘導(dǎo)的心肌收縮功能衰竭的主要介導(dǎo)物［2］。但是，尚不清楚運(yùn)動(dòng)生成的過(guò)量超氧陰離子是否也誘導(dǎo)組織ONOO－生成。本研究假設(shè)力竭運(yùn)動(dòng)后，心肌ONOO－的大量生成可能導(dǎo)致心肌疲勞，心臟輸血功能的下降是產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)性疲勞的原因。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠16只，6周齡，體重200－250 g，購(gòu)于湖南中南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，分籠飼養(yǎng)（每籠4只），自由進(jìn)水、飲食（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物常規(guī)飼料喂養(yǎng)），環(huán)境溫度18～22℃，濕度40%－60%，自然晝夜節(jié)律變化光照。

1.2 動(dòng)物分組與運(yùn)動(dòng)方案

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)三天，隨機(jī)分為2組：安靜組（C組，n＝8），運(yùn)動(dòng)組（E組，n＝8）。

安靜組（C組）：正常籠內(nèi)生活，不施加運(yùn)動(dòng)負(fù)荷。

運(yùn)動(dòng)組（E組）：力竭運(yùn)動(dòng)前三天進(jìn)行適應(yīng)性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，跑速10 m／min，每次5－10 min。第四天進(jìn)行跑臺(tái)力竭運(yùn)動(dòng)，前20 min以20 m／min的速度進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，20 min后每5 min提速15%直至力竭。整個(gè)運(yùn)動(dòng)過(guò)程采用跑臺(tái)的聲、光、電刺激強(qiáng)迫大鼠持續(xù)運(yùn)動(dòng)。大鼠力竭標(biāo)準(zhǔn)為：兩眼無(wú)光，毛發(fā)豎起，聲光電刺激無(wú)反應(yīng)，翻身后無(wú)力掙扎。

1.3 樣本的采集與處理

大鼠力竭后即刻麻醉、解剖、取樣。用水合氯醛30 mg／kg腹腔麻醉，暴露腹腔，左心室取血后迅速取心室肌組織。全血室溫靜置3小時(shí)，常溫3 000 rpm離心10 min取上清，－20℃保存待測(cè)。取出的心肌用0.9%NaCl溶液清洗，去除血液、結(jié)締組織，濾紙濾干，勻漿管密封，－20℃保存，以備勻漿，所有操作在冰上完成。

1.4 測(cè)試指標(biāo)與方法

MDA測(cè)試：采用微量丙二醛測(cè)定試劑盒測(cè)定，試劑盒購(gòu)于南京建成科技有限公司，按試劑盒說(shuō)明操作。

SOD測(cè)試：采用超氧化物歧化酶試劑盒測(cè)定，試劑盒購(gòu)于碧云天生物科技有限公司，按試劑盒說(shuō)明操作。

NO測(cè)試：采用硝酸還原酶法測(cè)定，試劑盒購(gòu)于南京建成科技有限公司，按試劑盒說(shuō)明操作。

ONOO－測(cè)定：采用酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定，試劑盒武漢貝茵萊生物科技有限公司，按試劑盒說(shuō)明操作。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Prism統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示，P＜0.05代表顯著性差異，P＜0.01代表極顯著性差異。

2 結(jié)果

如表1所示，力竭運(yùn)動(dòng)后，E組和C組相比，大鼠心肌ONOO－生成明顯升高，增高43%（P＜0.05，見(jiàn)圖1）；心肌MDA濃度上升52%（P＜0.05，見(jiàn)圖2）；心肌SOD活力下降60%，有非常顯著性差異（P＜0.01，見(jiàn)圖3）。E組較C組比的血清中NO含量有小幅上升，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)圖4）。提示力竭運(yùn)動(dòng)可使大鼠心肌自由基產(chǎn)生增多，抗氧化能力下降，脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高。

表1 大鼠血清NO、心肌MDA、SOD和ONOO－變化

圖1 力竭運(yùn)動(dòng)E組和C組ONOO－比較（＊P＜0.05：表示與C組相比）

3 討論

圖2 力竭運(yùn)動(dòng)E組和C組心肌MDA含量比較（＊P＜0.05：表示與C組相比）

圖3 力竭運(yùn)動(dòng)E組和C組心肌SOD活力比較（＊＊P＜0.01：表示與C組相比）

圖4 力竭運(yùn)動(dòng)E組和C組血清NO的比較

ONOO－是游離酪氨酸或蛋白質(zhì)酪氨酸硝基化形成的穩(wěn)定的終末代謝物，是蛋白質(zhì)硝基化的特異性標(biāo)志物，是介導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷作用的重要環(huán)節(jié)，是近年來(lái)細(xì)胞損傷機(jī)制研究的熱點(diǎn)之一。在生物體內(nèi)，ONOO－主要來(lái)源于NO和O2－。的快速非酶促反應(yīng)。NO／O2－。反應(yīng)形成ONOO－，其過(guò)程是不可逆的，此反應(yīng)的速率［6.7×109 molP（L·s）］遠(yuǎn)大于超氧化物歧化酶／O2－。反應(yīng)的速率［2×109 molP（L·s）］［3］，而且無(wú)需酶催化，只要同時(shí)有大量NO和O2－。生成，NO／O2－。反應(yīng)形成ONOO－就占主導(dǎo)地位。有研究指出ONOO－還有另一種生成途徑［6］，即NO／亞鐵細(xì)胞色素C途徑。NO與亞鐵細(xì)胞色素C反應(yīng)生成NO－和高鐵細(xì)胞色素C，NO－再與O2－。反應(yīng)生成ONOO－。

ONOO－在生物體內(nèi)主要是通過(guò)以下幾種途徑發(fā)揮作用［7］。1）強(qiáng)氧化作用，ONOO－是一種強(qiáng)效氧化劑，其氧化能力比過(guò)氧化氫大2 000倍，能與多種分子發(fā)生反應(yīng)，特別是氧化鐵／硫中心、鋅指結(jié)構(gòu)和蛋白巰基，引起蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA的氧化性損害［3－5］。2）硝基化作用，ONOO－與蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸反應(yīng)形成硝基酪氨酸而影響蛋白質(zhì)功能［3－5］。研究認(rèn)為，硝基酪氨酸是ONOO－細(xì)胞毒性的主要介導(dǎo)分子［8］。低濃度ONOO－即可使酪氨酸硝基化，不可逆地降低心肌收縮和舒張功能［9］。3）影響能量代謝，酶蛋白被氧化或硝基化后活性減低，如線粒體ATP合成酶、烏頭酸酶活性受抑制導(dǎo)致能量生成減少［10］。4）干擾鈣運(yùn)轉(zhuǎn)，ONOO－可干擾細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，Ca2＋內(nèi)流增加，引起細(xì)胞鈣超載，損害心肌細(xì)胞，并導(dǎo)致心肌細(xì)胞機(jī)械功能障礙，甚至停搏于舒張期［11，12］。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)急性力竭運(yùn)動(dòng)后，大鼠肝線粒體的Ca2＋濃度上升，細(xì)胞內(nèi)鈣過(guò)量可進(jìn)一步通過(guò)產(chǎn)生各種氧自由基、NO和其毒性產(chǎn)物—過(guò)氧亞硝基陰離子（ONOO－）的方式，過(guò)度活化蛋白激酶C（PKC），Ca2＋／Ca調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ、磷酸磷脂酶等生物大分子降解，損傷細(xì)胞線粒體功能，加重細(xì)胞酸中毒，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［13］。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)力竭運(yùn)動(dòng)組的ONOO－含量顯著高于安靜組，推測(cè)這可能與力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大量活性氧生成有關(guān)，尤其是O2－。和NO過(guò)量生成有關(guān)。

MDA是公認(rèn)的衡量機(jī)體自由基代謝的敏感指標(biāo)，其生成量不僅反映氧自由基生成與否，還反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度，因而測(cè)定MDA含量可推測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，同時(shí)因其壽命長(zhǎng)、毒性大，還可引起其他物質(zhì)產(chǎn)生過(guò)氧化作用的連鎖反應(yīng)，所以MDA的含量還可反映組織損傷的程度。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠心肌MDA含量明顯升高，表明力竭運(yùn)動(dòng)后心肌中氧自由基顯著增加。SOD對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶可通過(guò)催化超氧陰離子形成過(guò)氧化氫而清除超氧陰離子，保護(hù)機(jī)體免受損傷，因而SOD活性的高低是機(jī)體抗氧化能力強(qiáng)弱的標(biāo)志。SOD可催化超氧陰離子生成過(guò)氧化氫，并在過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）作用下分解為氧和水而被清除，因而SOD活性的高低對(duì)維護(hù)自由基代謝的平衡尤為重要。結(jié)果顯示，力竭運(yùn)動(dòng)后心肌中SOD顯著下降，說(shuō)明機(jī)體清除自由基能力明顯降低。形成此現(xiàn)象的原因可能與力竭運(yùn)動(dòng)后自由基產(chǎn)生增加，SOD消耗太多有關(guān)。由MDA，SOD的檢測(cè)結(jié)果可推測(cè)，力竭運(yùn)動(dòng)后，機(jī)體的氧化程度明顯升高，抗氧化能力顯著下降，心肌中自由基濃度顯著升高。由于機(jī)體清除自由基能力的減弱，氧自由基增多，其中O2－在一定程度上也顯著增多。NO有細(xì)胞保護(hù)作用，而NO／O2－。反應(yīng)形成的ONOO－則具有細(xì)胞毒作用。動(dòng)物體內(nèi)NO生物合成的唯一途徑是NO合酶（nitric oxide synthase，NOS）的 酶 促 反 應(yīng)［14］。NOS有 三 個(gè) 亞 型，分 別 為eNOS，nNOS，iNOS。近年來(lái)在運(yùn)動(dòng)生化方面有大量關(guān)于NO的相關(guān)研究。劉鴻宇等研究認(rèn)為，反復(fù)運(yùn)動(dòng)疲勞后大鼠乳頭體各部nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量和面積顯著增加，NO可能是乳頭體參與疲勞應(yīng)激反應(yīng)中的一種遞質(zhì)［16］。李麗等研究認(rèn)為，過(guò)度訓(xùn)練可導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性腎損傷，進(jìn)而引起運(yùn)動(dòng)性球－管混合型蛋白尿，其機(jī)理之一可能是腎缺血再灌注時(shí)其機(jī)理之一可能是腎缺血再灌注時(shí)iNOS活性增強(qiáng)，誘導(dǎo)NO增多，引起腎小管功能障礙［17］。敬繼紅等發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致腦組織中NO的大量生成，并引起腦損傷［18］。在運(yùn)動(dòng)中，機(jī)體NO的升高會(huì)損害機(jī)體組織。由于NO半衰期很短，很難檢測(cè)組織中的NO，但從檢測(cè)到的血清中NO的含量也有上升趨勢(shì)，可以推測(cè)，力竭運(yùn)動(dòng)可能導(dǎo)致NO的過(guò)量生成，心肌大量生成的ONOO－可能是由于運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的O2－。與NO反應(yīng)所致。

本研究表明，力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)心肌過(guò)氧亞硝酸基的大量生成，其機(jī)制是源于力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)心肌O2－。的大量生成與NO的過(guò)量生成。心肌ONOO－的大量生成可能導(dǎo)致心肌疲勞，心臟輸血功能的下降是產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)性疲勞的原因。

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