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        Caco-2細(xì)胞中8-羥基二氫小檗堿和小檗堿對(duì)多藥耐藥基因表達(dá)的研究

        2013-06-07 10:04:57熊茂來向紹蓉湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院湖北恩施445000湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院湖北恩施445000
        中國民族民間醫(yī)藥 2013年23期
        關(guān)鍵詞:小檗羥基耐藥

        熊茂來向紹蓉.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院,湖北 恩施 445000;.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院,湖北 恩施 445000

        【摘 要】 目的:研究8-羥基二氫小檗堿和小檗堿與多藥耐藥基因之間的作用。方法:采用MTT比色法測(cè)定藥物的細(xì)胞毒濃度,適時(shí)定量PCR測(cè)定不同多藥耐藥基因的表達(dá)。結(jié)果:在1~100μM濃度范圍內(nèi),8-羥基二氫小檗堿和小檗堿對(duì)Caco-2細(xì)胞無毒性作用;8-羥基二氫小檗堿和小檗堿對(duì)mdr 1和m rp 1的表達(dá)作用一致,在25~100μM范圍內(nèi),小檗堿能明顯降低mrp 2的mRNA表達(dá),而8-羥基二氫小檗堿對(duì)其無明顯影響。結(jié)論:8-羥基二氫小檗堿與小檗堿對(duì)mrp 2的基因表達(dá)差異較大,其對(duì)MRP 2蛋白表達(dá)的作用以及與基因調(diào)控之間的作用關(guān)系還有待更進(jìn)一步的研究。

        【關(guān)鍵詞】8-羥基二氫小檗堿;小檗堿;Caco-2細(xì)胞;多藥耐藥基因

        【中圖分類號(hào)】R965【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1007-8517(2013)23-0008-03

        Caco-2細(xì)胞中8-羥基二氫小檗堿和小檗堿對(duì)多藥耐藥基因表達(dá)的研究

        熊茂來1向紹蓉21.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院,湖北 恩施 445000;2.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院,湖北 恩施 445000

        【摘 要】 目的:研究8-羥基二氫小檗堿和小檗堿與多藥耐藥基因之間的作用。方法:采用MTT比色法測(cè)定藥物的細(xì)胞毒濃度,適時(shí)定量PCR測(cè)定不同多藥耐藥基因的表達(dá)。結(jié)果:在1~100μM濃度范圍內(nèi),8-羥基二氫小檗堿和小檗堿對(duì)Caco-2細(xì)胞無毒性作用;8-羥基二氫小檗堿和小檗堿對(duì)mdr 1和m rp 1的表達(dá)作用一致,在25~100μM范圍內(nèi),小檗堿能明顯降低mrp 2的mRNA表達(dá),而8-羥基二氫小檗堿對(duì)其無明顯影響。結(jié)論:8-羥基二氫小檗堿與小檗堿對(duì)mrp 2的基因表達(dá)差異較大,其對(duì)MRP 2蛋白表達(dá)的作用以及與基因調(diào)控之間的作用關(guān)系還有待更進(jìn)一步的研究。

        【關(guān)鍵詞】8-羥基二氫小檗堿;小檗堿;Caco-2細(xì)胞;多藥耐藥基因

        【中圖分類號(hào)】R965【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1007-8517(2013)23-0008-03

        小檗堿(Berberine)存在于許多植物如黃連等的根和根皮中,具有顯著的抗菌活性。近年發(fā)現(xiàn)還有抗心律失常、降血脂等廣泛的藥理作用,尤其是其在糖尿病治療中的應(yīng)用有大量臨床報(bào)道[1]。但小檗堿很難從消化道吸收,其吸收困難的原因?yàn)樾¢迚A是腸上皮細(xì)胞的P-糖蛋白作用底物。8-羥基二氫小檗堿是小檗堿的衍生物其中一種[2],藥理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),8-羥基二氫小檗堿與小檗堿在藥理效應(yīng)同等的情況下,其應(yīng)用濃度較低,因此推測(cè)8-羥基二氫小檗堿的吸收好于小檗堿。因此,本文旨在研究8-羥基二氫小檗堿和小檗堿在與多藥耐藥基因之間的作用,探討兩者之間差異的可能原因。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器 超凈工作臺(tái)(北京昌平長城空氣凈化工程公司);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeus,德國);DM IRM型倒置顯微鏡(Leica,德國);熒光分析儀(Hitachi,日本);5810R型高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf,德國);7300型適時(shí)定量PCR儀(AB Inc.,美國);酶標(biāo)儀(Bio-Rad,美國)。

        1.2 試藥 鹽酸小檗堿(含量97.9%,中國藥品生物制品檢定所);8-羥基二氫小檗堿(含量95.1%,華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院陸付耳教授贈(zèng)與);胎牛血清(Hyclone,美國);DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco,美國);二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽(MTT);BCA蛋白分析試劑盒(Pierce,美國);tRNA提取試劑(RNA STAT 60,TEL-TEST Inc.,美國)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 Caco-2細(xì)胞培養(yǎng) Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)基采用10g/L的DMEM高糖溶液,加入10%胎牛血清,添加青霉素(10萬單位/L)、1%的非必需氨基酸和0.1 g/L的鏈霉素,培養(yǎng)條件為恒溫37℃和5%CO2,消化液為0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液。

        調(diào)整Caco-2細(xì)胞密度為(1~2)×104個(gè)/ml,接種200L于96孔上,貼壁后,加入含藥物的培養(yǎng)液,用于細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn);調(diào)整Caco-2細(xì)胞密度為1×105個(gè)/m l,接種1m l于60mm培養(yǎng)皿上,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔2天更換一次培養(yǎng)液,培養(yǎng)約7天形成單分子層膜后,用于RTPCR實(shí)驗(yàn)。

        2.2 Caco-2細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn) 采用MTT法檢測(cè)小檗堿和8-羥基二氫小檗堿對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性作用。96孔板接種細(xì)胞后24h,加入含藥物的培養(yǎng)液,再培養(yǎng)24h后,加入5mg/ml的MTT溶液20Ll,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,去上清液,再加入DMSO溶劑200μI,放置于水平振蕩器上振蕩約10min,置酶標(biāo)儀中490nm處測(cè)定OD值。結(jié)果見圖1。經(jīng)雙側(cè)t檢驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析表明,在1~100μM濃度范圍內(nèi),小檗堿和8-羥基二氫小檗堿對(duì)Caco-2細(xì)胞無毒性作用;在150μM濃度和200μM濃度時(shí),小檗堿和8-羥基二氫小檗堿對(duì)Caco-2細(xì)胞活力有顯著毒性影響(P<0.01)。

        圖1 不同濃度8-羥基二氫小檗堿和小檗堿溶液對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性影響(χ±s,n=8)

        2.3 適時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn) 60mm培養(yǎng)皿中接種Caco-2細(xì)胞后,培養(yǎng)5天至融合,加入8-羥基二氫小檗堿或小檗堿溶液(5~100μM)孵育24 h后,收集細(xì)胞,提取總RNA,并合成cDNA。設(shè)計(jì)的mdr 1,mrp 1和mrp 2引物見表1。36B4作為內(nèi)參,每個(gè)反應(yīng)體系總體系為14μL,包括2.33 pmol引物,4 ng cDNA,7μL SYBR Green PCR反應(yīng)液。RT-PCR實(shí)驗(yàn)條件如下:50℃2min,95℃10 min,95℃15 s和60℃1min循環(huán)40次。計(jì)算方式如下[3]:mRNA量=2(CT-CT36B4),CT表示儀器測(cè)定某種基因的擴(kuò)增次數(shù),CT36B4表示儀器測(cè)定內(nèi)參36B4的擴(kuò)增次數(shù),以空白組數(shù)值為1。結(jié)果見圖2。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),隨著濃度升高,小檗堿和8-羥基二氫小檗堿對(duì)mdr 1的表達(dá)略有降低的趨勢(shì),但與空白組相比無明顯差異;小檗堿和8-羥基二氫小檗堿對(duì)m rp 1的表達(dá)無明顯影響;8-羥基二氫小檗堿對(duì)m rp 2的表達(dá)無明顯影響,但在25~100μM范圍內(nèi),小檗堿能明顯降低mrp 2的mRNA表達(dá)。

        表1 適時(shí)定量PCR的引物.

        圖2 8-羥基二氫小檗堿和小檗堿對(duì)mdr 1(A),mrp 1(B)和m rp 2(C)mRNA表達(dá)的影響(χ±s,n=3)

        3 討論

        采用Caco-2細(xì)胞進(jìn)行藥物吸收機(jī)制的研究,是一種很好的模擬腸管真實(shí)生存環(huán)境的體外方法,藥物透過Caco-2細(xì)胞層的體外過程與藥物口服在腸中的吸收有良好的相關(guān)性,在此基礎(chǔ)上該模型還可用來研究載體如多藥耐藥蛋白與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)系,此方法便捷,重現(xiàn)性好,使我們?cè)诩?xì)胞水平上認(rèn)識(shí)藥物在腸中的吸收達(dá)到了一個(gè)新水平。

        小檗堿作為一種天然植物生物堿成分,其理化性質(zhì)、體內(nèi)、外的吸收已有一些文獻(xiàn)報(bào)道[4-6]。研究表明,小檗堿很難經(jīng)消化道被人體吸收,僅有約5%的小檗堿從消化道吸收,而且吸收過程個(gè)體差異很大。此外,認(rèn)為腸上皮細(xì)胞的P-糖蛋白參與小檗堿的向腸腔內(nèi)外排,從而減少其吸收。8-羥基二氫小檗堿是根據(jù)小檗堿的前藥原理合成的,在小檗堿的C8位加入羥基,使其C環(huán)發(fā)生一系列變化,季胺N變成叔胺N。該衍生物是一分子狀態(tài),易與細(xì)胞膜嵌合,從而較易通過細(xì)胞膜而被人體吸收,到達(dá)體液循環(huán)系統(tǒng)后在體內(nèi)酶的作用下,轉(zhuǎn)化成小檗堿,保留了其功能團(tuán)部位,而發(fā)揮藥理活性。

        研究結(jié)果表明,在對(duì)多藥耐藥基因表達(dá)的影響方面,與小檗堿降低mrp 2表達(dá)相比,8-羥基二氫小檗堿對(duì)其表達(dá)無影響,而在對(duì)mdr 1和m rp 1的表達(dá),兩者作用趨勢(shì)相同。據(jù)已有報(bào)道表明,小檗堿吸收少與P-糖蛋白介導(dǎo)的藥物外排泵相關(guān),加入P-糖蛋白抑制劑能增加小檗堿的腸道吸收,而本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果為小檗堿不但沒有增加反而有降低多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP 2基因的表達(dá),而且8-羥基二氫小檗堿與小檗堿對(duì)mrp 2的表達(dá)差異較大,因此其對(duì)MRP 2蛋白表達(dá)的作用以及與基因調(diào)控之間的作用關(guān)系還有待更進(jìn)一步的研究。

        [1]P.J.Gibbs,Seddon K.R..Berberine[J].Alternative Medicine Review,2000,5(2):175-177.

        [2]徐麗君,陸付耳,魏世超,等.8-羥基二氫小檗堿與鹽酸小檗堿治療大鼠2型糖尿病的對(duì)比研究[J].中西醫(yī)結(jié)合研究,2009,1(4):173-176.

        [3]G.Liang,J.Yang,J.D.Horton,et al..Diminished hepatic response to fasting/refeeding and liver X receptor agonists in mice with selective deficiency of sterol regulatory element-binding protein-1c[J].J.Biol.Chem.,2002,277(10):9520-9528.

        [4]Nobukazu Shitan,Miyako Tanaka,Koichiro Terai,et al.Human MDR1 and MRP1 recognize berberine as their transport substrate[J].Biosci.Biotechnol.Biochem.,2007,71(1):242-245.

        [5]潘國宇,王廣基,孫建國,等.小檗堿對(duì)葡萄糖吸收的抑制作用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2003,38(12):911-914.

        [6]Guoyu Pan,GuangjiWang,Xiaodong Liu,et al.The Involvement of PGlycoprotein in Berberine Absorption[J].Pharmacol.Toxicol,2002,91(1):193-197.

        Study of 8-Hydroxydihydroberberine and Berberine on multidrug resistance gene in Caco-2 cellmodel

        XIONGMao-lai1XIANG Shao-rong2
        1.Themedical college of Hubei university for nationalities,Enshi445000,China;
        2.Affiliated mingda hospital of Hubei University for nationalities,Enshi445000,China

        Objective To investigate the effect of8-h(huán)ydroxydihydroberberine and berberine onmultidrug resistance gene using Caco-2 cellmodel.M ethod The damage of8-h(huán)ydroxydihydroberberine and berberine to Caco-2 cellwas evaluated by the MTTmethod.Expression ofmultidrug resistance gene includingmdr 1,mrp 1 and mrp 2 was determined by quantitative real time PCR.Result 8-h(huán)ydroxydihydroberberine and berberine had no damage to the growth of the Caco-2 cells in the concentrations of1~100μM.8-Hydroxydihydroberberine and berberine had the same effects on the expression of mdr 1 and mrp 1 gene.Berberine significantly decreased the expression ofmrp 2 gene in the concentration of 25~100μM,but there was no effect in 8-h(huán)ydroxydihydroberberinetreated groups.Conclusion The difference on the expression ofmrp 2 of 8-h(huán)ydroxydihydroberberi-ne and berberinemay imply to further study the effects on the proteins and the relationship of them.

        8-h(huán)ydroxydihydroberberine;berberine;Caco-2 cell;multidrug resistance gene

        2013.09.27)

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