王欣美 王 柯 季 申

上海市食品藥品檢驗所，上海 201203

柱前衍生高效液相色譜法測定太子參中精氨酸的含量

王欣美 王 柯 季 申

上海市食品藥品檢驗所，上海 201203

目的：建立太子參藥材中精氨酸的含量測定方法。方法：樣品用0.1mol／L鹽酸－乙醇（9：1）混合溶液提取，采用鄰苯二甲醛（OPA）與一氯甲酸芴甲酯（FMOC）聯(lián)用全自動柱前衍生化，Hypersil ODS柱，波長為338nm，檢測太子參藥材中精氨酸的含量。結(jié)果：精氨酸在0.2～4μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為101.2%。結(jié)論：本方法靈敏、準確，快速，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可用于太子參中精氨酸的含量測定。不同產(chǎn)地來源、不同批次太子參中的精氨酸含量存在一定差異。

太子參；氨基酸；柱前衍生；HPLC

太子參為《中國藥典》收載的常用補益中藥，別名孩兒參、童參、四葉參、米參等，系石竹科植物孩兒參［Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax］的干燥塊根，具有益氣健脾、生津潤肺等功效。臨床用于脾虛體倦、食欲不振、病后虛弱、氣陰不足、自汗口渴、肺燥干咳等癥狀。研究表明，太子參中含有環(huán)肽、氨基酸、多糖等化學(xué)成分。其中，氨基酸是太子參滋補功能的重要藥用成分，與太子參的補益功效有著非常密切的關(guān)系［1－4］。因此，太子參中氨基酸成分應(yīng)作為質(zhì)量標準控制的一個重要指標，但在中國藥典尚未制定氨基酸含量測定的相關(guān)標準。

氨基酸分析常用的方法主要有衍生化離子交換色譜法和衍生化高效液相色譜法，前者需要使用氨基酸分析儀，后者使用一般分析實驗室常規(guī)配備的高效液相色譜儀和C18色譜柱即可完成，且分析時間短，靈敏度高，已逐漸取代氨基酸分析儀在許多領(lǐng)域中的應(yīng)用。常用的柱前衍生化HPLC測定氨基酸的方法有AQC（6－氨基喹啉－N－羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯）法、DNFB（2，4－二硝基氟苯）法、DABS（磺酰氯二甲胺偶氮苯）法、PITC（異硫氰酸苯酯）法和OPA－FMOC（鄰苯二甲醛和9－芴甲基氯甲酸酯）法等。前4種方法需手工衍生，反應(yīng)活性差、速度慢且易受試劑干擾。OPA－FMOC法可克服上述缺點，應(yīng)用廣泛［5－6］

本文采用鄰苯二甲醛（OPA）與一氯甲酸芴甲酯（FMOC）聯(lián)用全自動柱前衍生化高效液相色譜法建立了太子參中精氨酸的含量測定方法。分離效果好，譜圖重現(xiàn)性好，分析和檢測結(jié)果令人滿意，可推廣應(yīng)用于中藥材中氨基酸類成分含量測定。

1 儀器與試藥

Agilent1100系列高效液相色譜儀；DAD檢測器；精氨酸對照品（批號：024－201004，由中國食品藥品檢定研究院提供），一氯甲酸芴甲酯（FMOC）（批號：FA120119，購自LANCASTER公司）；乙腈、甲醇、四氫呋喃為色譜純，其他試劑均為分析純。太子參藥材來自福建、湖南、安徽，經(jīng)上海市食品藥品檢驗所季申主任藥師鑒定。

表1 太子參產(chǎn)地及編號

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Hypersil ODS色譜柱（4.6mm×200mm，5μm）色譜柱；柱溫25℃；流動相為A：B（92：8），A為醋酸鈉溶液（取0.272%醋酸鈉溶液1000mL，加三乙胺0. 2mL，四氫呋喃6mL，用2%醋酸溶液調(diào)節(jié)pH值至7.20），B為13.6%醋酸鈉溶液（用2%醋酸溶液調(diào)節(jié)pH值至7.20）－乙腈－甲醇（40：70：90）；檢測波長為338nm；流速1.0mL／min。

在上述色譜條件下，供試品中精氨酸與其它色譜峰分離度良好。為確保定量分析的準確性，在系統(tǒng)適用性實驗中精氨酸理論塔板數(shù)不得低于5000。見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末（過三號篩）1g，精密稱定，精密加入0.1mol／L鹽酸－乙醇（9：1）混合溶液20mL，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，溶入0.1mol／L鹽酸－乙醇（9：1）混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品溶液的制備精密稱取精氨酸對照品適量，加0.1mol／L鹽酸－乙醇（9：1）混合溶液制成1.2mg／mL的溶液，即得。

2.4 衍生化試劑的配制 0.4 mol／L硼酸緩沖液（pH10.2）：取硼酸，配制成0.4 mol／L的溶液，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至10.2，即得（冷藏）。1%鄰苯二甲醛（OPA）溶液：稱取鄰苯二甲醛（OPA）80mg，加硼酸緩沖液（pH10.2）7 mL，乙腈1mL，巰基丙酸125μL，混勻，即得（冷藏）。0.5%一氯甲酸芴甲酯（FMOC）溶液：稱取一氯甲酸芴甲酯（FMOC）50mg，用乙腈適量使溶解，并稀釋至10mL即得（冷藏）。

2.5 標準曲線的繪制 精密稱取精氨酸對照品適量，加0.1mol／L鹽酸－乙醇（9：1）混合溶液制成濃度為20mg／m L的對照品貯備溶液。精密量取對照品貯備溶液適量，加0.1 mol／L鹽酸－乙醇（9：1）混合溶液，分別稀釋成0.2、0.4、0.8、1.2、2、4 mg／mL的溶液，作為對照品溶液，分別進樣1μL，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標Y，進樣量（μg）為橫坐標X，繪制標準曲線，結(jié)果回歸方程為：Y＝1859.4X＋2.0015（r＝0.9999），在0.2～4μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 重復(fù)性試驗 取本品粉末（TZS－2，過三號篩）1g，一式6份，按照上述條件測定，計算含量和RSD，結(jié)果精氨酸含量為24.60、24.84、25.32、25.15、25.78、25.15 mg／g，RSD為1.6%。

2.7 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，分別于0、2.5、5、7.5、10、12、24h測定，記錄精氨酸的峰面積，計算RSD（n＝6）為0.87%，表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗 取本品粉末（TZS－2，過三號篩）0.5 g，精密稱定，一式9份，分別精密加入15.182 mg／mL的精氨酸對照品溶液0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL（各3份），再分別精密加入0.1 mol／L鹽酸－乙醇（9：1）混合溶液20 m L，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，溶入0.1 mol／L鹽酸－乙醇（9：1）混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗測定結(jié)果（n＝9）

2.9 樣品測定 取各批樣品，按供試品溶液的制備方法分別制備供試品溶液，測定精氨酸的含量，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地，不同批次的太子參的精氨酸含量有一定的差異。

表3 樣品測定結(jié)果

3 討論

采用柱前衍生化高效液相色譜法測定太子參中精氨酸的含量，操作簡單，衍生化完全，可作為衡量太子參中氨基酸含量水平的一個有效評價方法。含量分析表明，太子參藥材中精氨酸的含量較高，但不同產(chǎn)地來源，不同批次藥材中精氨酸的含量存在一定差異，反映出了太子參藥材的質(zhì)量差異。精氨酸的含量可以作為太子參質(zhì)量評價的一個指標。

試驗考察了338、280、262、230、210nm波長下色譜峰的情況，結(jié)果在210nm下基線漂移嚴重，262、230、280 nm下所得色譜圖中衍生化試劑的紫外吸收較大，338nm為精氨酸的次最大吸收波長，且在該波長下衍生化試劑吸收很小，因此選擇338nm作為檢測波長。

氨基酸的提取一般選用水或0.1 mol／L鹽酸溶液，考慮到富氨基酸的水溶液易長菌，宜加入一定量的乙醇。試驗考察了水、0.1mol／L鹽酸溶液、0.1mol／L鹽酸－乙醇（9：1）混合溶液和30%乙醇溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.1mol／L鹽酸－乙醇（9：1）混合溶液的提取率較高，雜質(zhì)較少。故選擇0.1mol／L鹽酸－乙醇（9：1）混合溶液作為提取溶劑。

為得到最佳的供試品提取方法，試驗比較了超聲處理1h和加熱回流1 h，結(jié)果加熱回流的提取效率較高，首先確定了加熱回流的提取方式。再分別考察了不同的加熱回流時間（0.5、1、2、3 h）的提取效率，結(jié)果不同提取時間的提取效率基本一致，因此確定供試品提取方法為加熱回流1h。

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Pre－column derivatization RP－HPLC determ ination of arginine inPseudostellaria heterophy lla

Wang XinmeiWang Ke Ji Shen
Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai，201210

ObjectiveAn Pre－column derivatization RP－HPLCmethod was developed to analyze arginine in Pseudostellaria heterophylla.M ethod：The samples were extracted with 0.1mol／L hydrochloride acid－alchohol（9：1）solution.The Extracts were pre－columnly derived with o－phthaldialdehyde（OPA）and fluorenylmethyl chloroformate（FMOC）and determined at338nm.Result：The calibration curve was in good linearity with in the range from0.2～4μg（r＝0.9999.The average recovery was 101.2（n＝6）.Conclusion：The method is simple，sensitive，accurate with high repeatability and stability，short－time－consum ing，which is applicable to the testing ofarginine in Pseudostellariaheterophylla.The contentarginine varied from cultivated placesand batches.

Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax；arginine；Pre－column Derivatization；HPLC

R927

A

1007－8517（2013）19－0007－03

2013.07.23）