趙婧雅王笑影曾海英黃潔洪群英葉欣朱冠山侯英勇張新

1.復旦大學附屬中山醫(yī)院呼吸科，上海200032；

2.復旦大學附屬中山醫(yī)院病理科，上海200032；

3.阿斯利康全球研發(fā)中國創(chuàng)新研究中心，上海 201203

直接測序法與蝎形探針擴增阻滯突變系統(tǒng)檢測肺癌小活檢標本EGFR基因突變的比較

趙婧雅1王笑影1曾海英2黃潔2洪群英1葉欣3朱冠山3侯英勇2張新1

1.復旦大學附屬中山醫(yī)院呼吸科，上海200032；

2.復旦大學附屬中山醫(yī)院病理科，上海200032；

3.阿斯利康全球研發(fā)中國創(chuàng)新研究中心，上海 201203

背景與目的：表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因的突變狀態(tài)與肺癌患者應用EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)的療效密切相關。目前，臨床上缺乏統(tǒng)一的方法檢測EGFR基因突變。本研究旨在探討直接測序法與蝎形探針擴增阻滯突變系統(tǒng)(scorpions amplification refractory mutation system，scorpions ARMS法)在檢測肺癌臨床活檢小標本EGFR突變時敏感性的差異，以及相關靶向治療療效的分析。方法：采用直接測序法和ARMS法共同檢測168例石蠟包埋肺癌標本，并隨訪評估其中行靶向治療患者的臨床療效。結(jié)果：手術標本80例中，直接測序法與ARMS法所檢出的突變陽性率分別為18.8%和25.0%，敏感性分別為71.4%和95.2%，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。而活檢小標本88例中，直接測序法與ARMS法所檢出的突變陽性率分別為19.3%和42.0%，敏感性分別為42.5%和92.5%，前者均顯著低于后者(P＜0.01)。靶向治療療效方面，直接測序法與ARMS法野生型患者客觀緩解率(objective response rate，ORR)分別為26.3%和3.8%，前者明顯高于后者(P＜0.05)，而在小活檢標本中，直接測序法野生型患者ORR達32.0%。直接測序法野生型患者中位無進展生存期(progression-free survival，PFS)為4.0個月，明顯長于ARMS法野生型患者的1.5個月(P＜0.05)。結(jié)論：對活檢小標本而言，ARMS法較直接測序法的敏感性更高，其檢測結(jié)果與臨床療效的一致性更好，纖維支氣管鏡活檢等小標本EGFR突變檢測更適合用ARMS法。

表皮生長因子受體；基因突變；活檢標本；EGFR酪氨酸激酶抑制劑

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)是針對晚期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)最重要的靶向治療藥物，包括吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)等在臨床上應用日益廣泛，目前已明確EGFR突變是反映EGFR-TKI療效的標志物。國內(nèi)外應用的EGFR突變檢測方法有多種，包括直接測序法、蝎形探針擴增阻滯突變系統(tǒng)(scorpions amplification refractory mutation system，scorpions ARMS)、液相芯片法等，這些方法各有優(yōu)缺點，至今國際上沒有明確臨床上檢測EGFR基因突變的標準方法，而直接測序法和ARMS法應用較廣［1–2］。確診晚期NSCLC主要通過纖維支氣管鏡、經(jīng)皮肺穿刺等活檢物病理檢查，與手術切除的大塊腫瘤組織相比，這些較小的活檢組織是否適合做EGFR突變檢測？選用不同的檢測方法，其檢測結(jié)果的差別有多大？不同的檢測方法指導臨床應用靶向藥物的有效性又如何？國內(nèi)外對檢測方法的比較有數(shù)篇研究，但鮮有研究關注活檢小標本，對上述問題的回答并不明確。為此，我們比較分析了直接測序法與ARMS法對手術切除標本與活檢小標本檢測結(jié)果的差異，并與肺癌EGFRTKI治療療效相比較，以明確對肺癌小活檢標本EGFR突變檢測的更佳方法。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

收集復旦大學附屬中山醫(yī)院2008年1月—2012年3月確診NSCLC患者168例(表1)。

表 1 入組患者臨床資料Tab. 1 Patients characteristics

168例患者中，手術切除腫瘤標本80例，纖維支氣管鏡、經(jīng)皮肺穿刺等取得的小活檢標本88例，均同時用直接測序法和ARMS法檢測EGFR基因突變情況。所有標本均為治療前取得。

1.2 DNA抽提

中性甲醛固定的手術標本切取4 μm厚切片3～5張，活檢標本切取切片10張，所有標本均同時完成一張常規(guī)HE染色切片，并由病理科醫(yī)生鑒定腫瘤細胞的存在。DNA抽提采用QIAamp DNA FFPE 組織試劑盒(購自Qiagen公司)，實驗步驟依據(jù)說明書。提取并重懸后的DNA經(jīng)紫外分光光度計檢測其總量及純度。

1.3 直接測序分析

根據(jù)GenBank公開發(fā)表的人EGFR基因序列 (編號AY588246)，采用ABI PrismTMPrimer Express軟件，采用PCR擴增法分別擴增EGFR 第18～21外顯子。其引物序列分別是：第18號外顯子上游引物(順義鏈)5’-GAGGTGACCCTTGTCTCTGTGT-3’，下游引物(反義鏈)5’-CCCAAACACTCAGTGAA ACAAA-3’；第19外顯子上游引物(順義鏈)5’-TGCCAGTTAACGTCTTCCTTCT-3’，下游引物(反義鏈)5’-TGAACATTTAGGATGTG GAGAT-3’；第20外顯子上游引物(順義鏈)5’-ACTTCACAGCCCTGCGTAAAC-3’，下游引物(反義鏈)5’-ATGGGACAGGC ACTGATTTGT-3’；第21外顯子上游引物(順義鏈)5’-GAGCTTCTTCCCATGA TGATCT-3’，下游引物(反義鏈)5’-GAAAAT GCTGGCTGACCTAAAG-3’。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后用ABI377測序儀進行雙向測序，測序結(jié)果采用Chromas軟件進行分析。

1.4 ARMS檢測

采用廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司推出的EGFR突變檢測試劑盒(ADx EGFR突變檢測試劑盒)，該試劑盒覆蓋了最常見的29種體細胞突變：外顯子18的3種點突變，外顯子19包括E746-A750片段在內(nèi)的19種缺失突變，外顯子20的T790M、S768I以及其他3種插入突變，外顯子21的L858R、L861Q突變。參與反應的DNA總量及反應條件均根據(jù)該試劑盒說明書要求，最終反應結(jié)果以ADx-EGFR突變檢測試劑盒提供的判讀原則確定標本EGFR基因突變狀態(tài)。

1.5 EGFR-TKIs治療評價

根據(jù)EGFR突變檢測結(jié)果和患者自身意愿，共有61例患者行規(guī)范二、三線口服吉非替尼(250 mg/d)或厄洛替尼(150 mg/d)并在我院常規(guī)隨訪。靶向治療開始后每1個月進行血清腫瘤標志物、胸部CT等影像學檢查，按照實體腫瘤療效評價標準(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST)［3］評價治療效果。無進展生存期(progression-free survival，PFS)定義為：靶向治療開始至隨訪第1次發(fā)現(xiàn)疾病進展的時間。

1.6 統(tǒng)計學處理

所有統(tǒng)計學檢驗采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩種方法在檢測手術標本與活檢標本EGFR突變陽性率的比較

168例入組的患者中，直接測序法檢測到EGFR基因突變者32例，陽性率為19.0%(32/168)，ARMS法檢測到突變者57例，陽性率為33.9%(57/168)，后者的突變陽性率明顯高于前者(P＜0.01)。80例手術標本中，直接測序法檢測到突變者15例，陽性率為18.8%(15/80)，ARMS法檢測到突變者20例，陽性率為25%(20/80)，兩種方法的突變率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.339)。而在88例活檢小標本中，直接測序法檢測到突變者17例，陽性率為19.3%(17/88)，ARMS法檢測到突變者37例，陽性率為42.0%(37/88)，ARMS法檢測活檢小標本的突變陽性率明顯高于直接測序法(P＜0.01，圖1)?？梢?，對于臨床標本的檢測，ARMS法較直接測序法擁有更高的突變檢出率，而這一差異主要是活檢小標本造成的。

圖 1 兩種檢測方法檢出EGFR突變率的比較Fig. 1 The comparison of EGFR mutation rate by ARMS and direct sequencing in surgical excision and biopsy samples

2.2 兩種方法在手術標本與活檢標本中檢測靈敏度的比較

168例NSCLC中，直接測序法靈敏度為52.5%(32/61)，ARMS法靈敏度為93.4%(57/61)，后者顯著高于前者(P＜0.01)。進一步分析80例手術標本，兩種檢測方法的靈敏度分別為71.4%(15/21)和95.2%(20/21)，兩者間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.125)。而88例活檢標本中，ARMS法檢測的靈敏度為92.5%(37/40)，明顯高于直接測序法的42.5%(17/40，P＜0.01)。兩種檢測方法的特異度均為100%。

80例手術標本中，兩種檢測方法結(jié)果不一致者7例，不一致率為8.8%，檢驗符合率為91.2%；而在88例活檢小標本中，ARMS法和直接測序法結(jié)果不一致者26例，不一致率29.5%，檢驗符合率70.5%，活檢標本的檢驗不一致率明顯高于手術標本(P＜0.01，表2)。

2.3 兩種方法檢測結(jié)果不一致的病例分析

ARMS法和直接測序法檢測結(jié)果不一致病例共33例，其中4例為直接測序法結(jié)果陽性而ARMS法未檢測到突變者，這4例標本包括2例第19外顯子的缺失突變和2例第20外顯子的插入突變，皆是ARMS試劑盒不包括的檢測位點。而在29例單獨ARMS法檢測到EGFR突變的病例中，10例復習原測序圖發(fā)現(xiàn)相應突變位點存在較低突變峰，與背景雜峰混雜無法判斷；其余19例標本重復兩種方法仍只有ARMS法檢測到EGFR基因突變。這29例標本中，23例為纖維支氣管鏡、經(jīng)皮肺穿刺取得的活檢標本，所占比例高達79.3%(圖2)。

表 2 兩種檢測方法在不同類型標本中敏感性比較Tab. 2 The comparison of sensitivity of two detecting methods among different type of specimens

2.4 手術標本與活檢標本腫瘤細胞比例的評估

圖 2 直接測序法與ARMS法檢測結(jié)果Fig. 2 The detecting results of direct sequencing and ARMS

對80例HE染色切片行腫瘤細胞比例評估。結(jié)果顯示，43例手術切除標本的腫瘤細胞比例均值為75.0%，遠高于37例活檢小標本的腫瘤細胞比例均值35.0%(P＜0.01)。腫瘤細胞比例低于20%的手術標本僅1例(2.3%)，而活檢標本共18例(48.6%)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.5 EGFR突變檢測結(jié)果與EGFR-TKI療效的關系

共61例NSCLC患者規(guī)范二、三線服用EGFR-TKI并有完整的隨訪資料，其中40例服用吉非替尼，21例服用厄洛替尼。直接測序法檢測為EGFR野生型患者的客觀緩解率(objective response rate，ORR)為26.3%，顯著低于突變型患者(56.5%，P＜0.05)；但單獨分析小活檢標本時，ORR在野生型與突變型患者中分別為32.0%和45.5%，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.475)。而根據(jù)ARMS的檢測結(jié)果，野生型與突變型患者靶向治療的ORR分別為3.8%和62.9%(P＜0.01)，且無論在手術標本或是活檢小標本中，EGFR突變組的ORR均明顯高于非突變組(表3)。值得注意的是，直接測序法確定為EGFR野生型的患者中，其靶向ORR顯著高于ARMS法確定為野生型的患者(26.3% vs 3.8%，P＜0.05)。另外，在小活檢標本中，直接測序法EGFR野生型組的ORR為32.0%。

根據(jù)直接測序法結(jié)果，EGFR野生型患者靶向治療的中位PFS為4.0個月(95%CI：2.5～5.5)，突變型為14.0個月(95%CI：9.7～18.3)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；ARMS法檢測為EGFR野生型患者的中位PFS為1.5個月(95%CI：0.5～2.5)，突變型為14.0個月(95%CI：12.7～15.3)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。進一步比較兩種檢測方法所得野生型患者的中位PFS，直接測序法野生型患者明顯長于ARMS法野生型患者(4.0個月 vs 1.5個月，P＜0.05，圖3)。

以直接測序法或ARMS法的任意一種檢測出突變即定義為EGFR突變陽性，則以上61例靶向治療患者中共36例攜帶EGFR突變，包括16例19外顯子缺失突變(44.4%)，18例L858R突變(50%)，1例L861Q突變(2.8%)以及1例20外顯子插入突變(2.8%)。單獨分析攜帶19外顯子缺失的患者和攜帶L858R突變患者間靶向治療療效的差異，發(fā)現(xiàn)中位PFS(17.0與13.0個月)和ORR(62.5% vs 66.7%)差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，表3)。

圖 3 不同方法檢測結(jié)果與患者PFS分析Fig. 3 The analysis of progression-free survival (PFS) and EGFR mutation status detected by ARMS and direct sequencing

表3 兩種方法檢測不同類型標本EGFR基因突變情況與臨床療效分析Tab. 3 The comparison of clinical outcomes and EGFR mutation status detected by two methods among different type of specimens

3 討 論

直接測序法和ARMS法在當前NSCLC的EGFR基因突變檢測工作中應用較為廣泛，而針對兩種檢測方法的相關研究也有多篇文獻報道。張靜等［4］曾單獨就兩種方法對手術切除標本檢測的靈敏性方面進行了比較；Ellison等［5］的研究中探討了包括以上兩種方法在內(nèi)的多種檢測方法，但對于檢測標本類型并未細分；而多篇報道中則主要討論了直接測序法和ARMS法針對腫瘤細胞學標本，尤其是癌性胸水時檢驗效能的比較［2,6–7］?？梢姡岳w維支氣管鏡、經(jīng)皮肺穿刺等途徑獲得并經(jīng)石蠟包埋處理的活檢小標本的EGFR基因檢測報道較少，而臨床上晚期NSCLC可獲得的腫瘤標本絕大多數(shù)是活檢小標本。因此，針對這類標本的EGFR突變檢測，選用以上哪種方法更為合適，其檢測結(jié)果能否準確預測靶向治療療效，相關問題的研究具有很高臨床指導作用。

以往相關研究顯示，直接測序法靈敏度有限，檢測腫瘤組織的突變含量至少達到20%才能被直接測序法檢出［8］，當腫瘤組織中混雜大量正常細胞時其突變信號受抑制，檢測效能顯著降低［5］。而以熒光定量PCR技術為基礎的ARMS法，其特異性探針僅識別并擴增EGFR突變序列，使得突變信號的收集過程較少受到腫瘤組織中混雜的正常細胞的干擾。因ARMS法的高選擇性及高靈敏性，即使腫瘤組織突變含量低至1%也能被其檢出。本次研究結(jié)果顯示，對于小活檢標本，直接測序法的突變檢出率明顯低于ARMS法(19.3% vs 42.0%，P＜0.01)，而在敏感性方面，直接測序法也比ARMS法低(42.5% vs 92.5%，P＜0.01)；ARMS法檢測到EGFR突變而直接測序法未檢測到突變的標本共29例，其中23例均為活檢小標本，比例高達79.3%?？梢娫谶M行活檢小標本的檢測時，考慮到突變檢出率和敏感性等方面，ARMS法較直接測序法更為可靠。

不同靈敏度的方法在檢測小活檢標本EGFR基因突變時檢出率等方面差別顯著的主要原因在于活檢小標本所含腫瘤細胞比例普遍較低。一方面，為提高臨床確診率，常常需要病灶處多部位活檢，從而導致所獲標本中混雜大量正常細胞；另一方面，手術切除標本在進行基因檢測前可經(jīng)過病理評估，將腫瘤區(qū)域圈出并人工刮除區(qū)域外正常細胞，使得處理后的手術標本所含腫瘤細胞比例達到90%以上，但小活檢標本中腫瘤細胞分布較為分散，無法通過上述簡單方法去除正常細胞，因此小活檢標本中腫瘤細胞比例顯著降低。本研究中專門對80例手術標本和活檢小標本的HE切片進行了病理評估，發(fā)現(xiàn)活檢小標本中腫瘤細胞比例低于手術標本(均值分別為35.0%和75.0%，P＜0.001)?？紤]到直接測序法靈敏度僅為20%，因此，應用靈敏度相對不足的直接測序法進行檢測時可導致假陰性結(jié)果的增加。

臨床檢測EGFR突變的目的在于預測NSCLC患者是否適合使用EGFR-TKI，因此，判斷EGFR突變檢測方法的選擇是否合適，主要標準在于其檢測結(jié)果與靶向治療療效間是否存在較高的一致性。本研究數(shù)據(jù)顯示，直接測序法檢測結(jié)果為野生型患者的ORR為26.3%，小活檢標本野生型患者ORR為32.0%，這意味著基因檢測判斷EGFR-TKI無效的患者中有25%的患者達到臨床緩解，說明所用的測序法顯然難以達到準確療效預測的目的。而ARMS法所得結(jié)果為野生型患者的ORR僅為3.8%，預測價值好得多。進一步對比靶向治療PFS，直接測序法野生型患者的中位PFS為4.0個月，而ARMS法野生型患者僅為1.0個月(P＜0.05)，分析每個患者的PFS，發(fā)現(xiàn)直接測序法確定為EGFR野生型的患者中有相當一部分仍能從靶向治療中獲益，這同樣歸因于小活檢標本測序法存在較高的假陰性率。對比國際上幾項大型臨床實驗，IPASS與First-SIGNAL研究［9-10］的入組患者非常相似，IPASS中EGFR野生型患者靶向治療的ORR僅為1.1%，而First-SIGNAL中野生型患者ORR高達25%，差異可能與兩項研究中EGFR突變檢測選用的方法不同有關(IPASS研究中為ARMS法，F(xiàn)irst-SIGNAL研究中為直接測序法)?？梢?，在臨床標本的檢測中，尤其是腫瘤細胞比例較低的小活檢標本，不同的檢測方法會對靶向治療療效的判斷產(chǎn)生影響，有時甚至影響到循證醫(yī)學的相關結(jié)論。

本研究也存在不足之處，由于EGFR突變檢測至今未確定“金標準”方法，計算直接測序法與ARMS法的敏感性數(shù)據(jù)是兩種方法互為對照得到的，而在特異性方面，我們定義只要檢測到EGFR突變者即為真陽性，因此兩法的特異性均為100%。對甲醛固定的標本是否存在假陽性的問題較難確認，本研究也未深入探究。Yam等［11］在研究中對此矛盾采取了與本研究類似的處理方法。

總而言之，直接測序法用于活檢小標本EGFR基因檢測時，其突變檢出率降低，且結(jié)果對臨床TKI療效預測的可靠性也相應下降。因此，對于小活檢標本應選用靈敏度相對較高的ARMS法，從而降低假陰性率，使更多患者獲得及時進行EGFR-TKI靶向治療的機會。

致謝

感謝阿斯利康制藥有限公司和廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司對本研究中的基因檢測提供的大力幫助。

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The comparison of EGFR mutation detection in clinical biopsy samples of lung cancer by ARMS and direct sequencing

ZHAO Jing-ya1, WANG Xiao-ying1, ZENG Hai-ying2, HUANG Jie2, HONG Qunying1, YE Xin3, ZHU Guan-shan3, HOU Ying-yong2, ZHANG Xin1(1. Department of Pulmonary Medicine, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2. Department of Pathology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China; 3. AstraZeneca Innovation Center China, Shanghai 201203, China)

ZHANG Xin E-mail: zhang.xin@zs-hospital.sh.cn

Background and purpose：Somatic mutations in the epidermal growth factor receptor (EGFR) gene have been identified as a major determinant of the response to the treatment with EGFR-tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in patients with lung cancer. At present, there is still no unified method to detect EGFR mutations in clinical practice. This study aimed to investigate the sensitivity of scorpions amplification refractory mutation system (Scorpions ARMS) in comparing with that of direct DNA sequencing in the detection of EGFR gene mutations in lung cancer clinical biopsy samples, and its correlation with clinical outcomes of EGFR tyrosine kinase inhibitors (EGFR-TKIs)therapy. Methods：Direct sequencing and ARMS were used simultaneously to detect EGFR mutation status in 168 formalin-fixed and parrffin-embeded (FFPE) lung cancer specimens, and the patients’ efficacy to TKIs was evaluated. Results：In 80 surgical excision samples, EGFR mutations were identified in 20 cases with a mutation rate of 25% by ARMS, while in 15 cases with a mutation rate of 18.8% by direct sequencing. Besides, the sensitivity of ARMS in surgical excision samples was 95.2% and that of direct sequencing was 71.4%. Neither mutation rate nor sensitivity between two methods showed statistical differences in the detection of surgical excision samples. In 88 biopsy samples, somatic mutations were identified in 37 cases with a mutation rate of 42.0% by ARMS, while in 17 cases with a mutation rate of 19.3% by direct sequencing. In addition, the sensitivity of ARMS in biopsy specimens was 92.5% and that of direct sequencing was 42.5%. There were significant differences of both mutation rate and sensitivity between two methods in the detection of biopsy samples (P＜0.01). Among the patients receiving TKI therapy, objective response rate (ORR) of EGFR wild-type detected by direct sequencing was much higher than that of wild-type detected by ARMS (26.3%, 3.8%, respectively, P＜0.05). The median progression-free survival (PFS) of patients with EGFR wildtype detected by direct sequencing was significantly longer than that of patients with wild-type detected by ARMS (4.0 months vs 1.5 months, P＜0.05). Conclusion：Compared to direct sequencing, ARMS gains a higher sensitivity in the detection of EGFR mutations in clinical biopsy samples, and the results from ARMS are more consistent to the efficacy of TKI treatment.

Epidermal growth factor receptor; Mutations; Biopsy samples; EGFR tyrosine kinase inhibitors

R734.2

：A

：1007-3639(2013)02-0106-08

2012-11-20

2013-01-15）

上海市重點學科建設項目(No:B115)。

張新 E-mail:zhang.xin@zs-hospital.sh.cn

DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2013.02.005