復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胰腺肝膽外科，胰腺腫瘤研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

下調(diào)組蛋白去乙?；?對胰腺癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)及放化療抵抗的影響

徐近 朱文偉 秦毅 許文彥 吉順榮 虞先濬

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胰腺肝膽外科，胰腺腫瘤研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

背景與目的：組蛋白去乙?；?(sirtuin type 1，SIRT1)在胰腺癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，可能與腫瘤的惡性表型相關(guān)。本研究采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)胰腺癌PANC1細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)，探討其對DNA損傷修復(fù)及放化療抵抗的影響。方法：用彗星試驗(yàn)檢測細(xì)胞敲除SIRT1后DNA損傷修復(fù)能力；蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測NBS1、γH2AX DNA修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平；最后用克隆存活實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)觀察胰腺癌細(xì)胞對放化療的敏感性。結(jié)果：下調(diào)SIRT1顯著抑制了胰腺癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力；抑制了DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白NBS1磷酸化活化；增強(qiáng)了細(xì)胞對放化療的敏感性。結(jié)論：SIRT1基因表達(dá)下調(diào)可抑制胰腺癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力，提高其對放化療的敏感性，機(jī)制上可能與SIRT1下調(diào)后NBS1磷酸化活化受抑制相關(guān)。

組蛋白去乙?；?；胰腺癌；DNA損傷修復(fù)；NBS1

放化療抵抗是胰腺癌治療失敗、疾病進(jìn)展的主要原因［1-2］。目前已知多種機(jī)制參與調(diào)控胰腺癌的治療抵抗［3］。既往研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)不僅是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因，而且和腫瘤的放化療抵抗密切相關(guān)［4-6］。

組蛋白去乙酰化酶1(sirtuin type 1，SIRT1)是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotin-amide adenine dinucleotide，NAD)的去乙?；福c多種細(xì)胞生物學(xué)功能如基因轉(zhuǎn)錄沉默、細(xì)胞生長周期調(diào)節(jié)、能量代謝包括糖異生和脂質(zhì)累積、胰島素分泌、血管生成、神經(jīng)保護(hù)、病毒感染以及細(xì)胞衰老有著密切關(guān)聯(lián)［7］。近期研究還發(fā)現(xiàn)，SIRT1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，甚至與腫瘤的化療耐藥密切相關(guān)［8］。

本研究采用RNA干擾技術(shù)抑制SIRT1基因在胰腺癌細(xì)胞系PANC1中的表達(dá)，研究PANC1細(xì)胞DNA損傷修復(fù)及放化療敏感性的差異變化；并檢測DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵蛋白NBS1磷酸化表達(dá)水平，初步分析SIRT1在胰腺癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心?？俁NA提取試劑TRIzol和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，TAKARA逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國GibcoBRL公司，SIRT1抗體、HRPB標(biāo)記二抗、NBS1抗體、p-NBS1抗體、γH2AX抗體及GAPDH抗體均購自美國Cell Signaling Technology(CST)公司，HRP顯色試劑盒購自Piece公司。實(shí)驗(yàn)中涉及的引物由上海Sangon公司合成，MTT細(xì)胞增殖試劑盒購自碧云天公司，Comet assay檢測試劑盒購自美國Trevigen公司。

1.2 方法

1.2.1 shRNA的設(shè)計(jì)及載體構(gòu)建

依據(jù)Ambion公司網(wǎng)頁上在線軟件設(shè)計(jì)針對SIRT1的shRNA表達(dá)序列，由生工合成寡核苷酸片段。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳后在紫外光下切下目的條帶，用Axygen膠回收試劑盒回收純化，經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切2 h，置于16 ℃ T4DNA連接酶連接過夜，用DH5α感受態(tài)細(xì)菌轉(zhuǎn)化，挑取單個(gè)菌落小提質(zhì)粒，酶切鑒定條帶位置正確后送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序鑒定。測序正確的質(zhì)粒采用質(zhì)粒大量抽提試劑盒(德國Eppendoff公司)，按使用說明書抽提純化質(zhì)粒，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和shRNA轉(zhuǎn)染

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1在含10%小牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)傳代。細(xì)胞以3×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板。當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到50%～70%時(shí)，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，具體操作按試劑說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入含有終濃度為200 nmol/L的shRNASIRT1-1、shRNASIRT1-2及shRNASIRT1-3質(zhì)粒的OPTIMEM無血清培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立對照組(轉(zhuǎn)染不針對任何靶基因的shRNA-SCR和野生型細(xì)胞WT)。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測

采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法測定RNA濃度。RNA逆轉(zhuǎn)錄的方法按試劑盒說明書進(jìn)行，這個(gè)過程置于冰上操作。對mRNA樣本經(jīng)紫外分光光度儀定量后，以500 ng mRNA為模板采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后以100 ng cDNA為模板根據(jù)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，RT-PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。此后采用TAKARA實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒處理樣品并在Eppendorf Mastercycler Realplex型實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)加做熔點(diǎn)曲線步驟檢測引物特異性，記錄各孔的CT值。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測

收集細(xì)胞，加入150 μL細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解。于冰上裂解20 min，所得裂解液以14 000×g，4 ℃離心1 min。BCA法檢測蛋白濃度，蛋白加上樣緩沖液95 ℃變性5 min后進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗(SIRT1、GAPDH、NBS1、p-NBS1和γH2AX；Cell signaling technology)雜交，4 ℃過夜，PBST洗膜3次，加羊抗兔IgGHRP，室溫雜交1 h，PBST洗膜3次。用化學(xué)發(fā)光法顯色，Las3000曝光機(jī)器曝光，根據(jù)膜顯影情況，適度調(diào)節(jié)曝光時(shí)間。

1.2.5 MTT增殖及克隆形成檢測

1.2.5.1 MTT增殖實(shí)驗(yàn)

取生長良好的兩種細(xì)胞shSCR-PANC1和shSIRT1-PANC1，消化并計(jì)數(shù)制備成單細(xì)胞懸液，均勻地接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔200 μL，含細(xì)胞5 000個(gè)，均設(shè)8個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞貼壁24 h后，分別加入相應(yīng)濃度順鉑(0、5、10和20 μg/mL)處理48 h后每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔再加上DMSO 150 μL，振蕩10 min，選擇490 nm波長測定各孔吸光度值(A)。

1.2.5.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將shSCR-PANC1和shSIRT1-PANC1細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，分別加入6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁48 h后置于6 MV直線加速器接受外照射，劑量分別為2、4和8 Gy。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2周后，純甲醛固定30 min，Giemsa染色15 min，晾干。計(jì)算細(xì)胞數(shù)大于50個(gè)的克隆數(shù)。

1.2.6 彗星檢測試驗(yàn)(Comet Assay)

shSCR-PANC1和shSIRT1-PANC1細(xì)胞分別接種2孔到6孔板中。其中1孔細(xì)胞不處理，1孔細(xì)胞用20 ng/mL的放線菌素D(ActD)處理6 h誘導(dǎo)凋亡。6 h后，吸棄培養(yǎng)基，胰酶消化重懸細(xì)胞，定量至106個(gè)/mL。用75 μL 0.5%(in PBS)低熔點(diǎn)膠和10 000個(gè)細(xì)胞(10 μL)混勻，滴加在正常熔點(diǎn)瓊脂糖膠上，裂解細(xì)胞，瓊脂糖膠凝固后，4 ℃浸泡在裂解緩沖液中2 h使細(xì)胞充分裂解。電泳(電泳前載玻片浸泡在電泳緩沖液中20 min，使其DNA充分解旋)，設(shè)定電壓24 V(大約0.74 V/cm)，電泳時(shí)間30 min。中和液中浸泡玻璃板5 min，重復(fù)3次，載玻片上瓊脂糖膠上滴加染色緩沖液，使其覆蓋整個(gè)區(qū)域，暗處放置10 min，然后在蒸餾水中清洗0.5 h。熒光顯微鏡下(紅色通道)拍照記錄。每個(gè)樣品中至少隨機(jī)挑選25個(gè)細(xì)胞測定，每組測定重復(fù)3次取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s 表示，組間差異采用配對t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染shRNA對PANC1細(xì)胞SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

設(shè)計(jì)針對SIRT1基因的3條小RNA干擾序列(shSIRT1-1-3)和隨機(jī)對照序列(shSCR)，轉(zhuǎn)染人胰腺癌PANC1細(xì)胞48 h后，RT-PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示，與WT和shSCR的對照細(xì)胞相比，表達(dá)干擾序列shSIRT1-3的細(xì)胞中SIRT1 mRNA和蛋白水平下調(diào)最顯著，抑制率可達(dá)90%以上(P＜0.001，圖1)。

2.2 下調(diào)SIRT1對細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力的影響

運(yùn)用20 ng/mL的ActD處理細(xì)胞誘變DNA損傷，測定對照細(xì)胞和SIRT1敲除細(xì)胞彗星率變化的差異。結(jié)果顯示，對照組(shSCR)和SIRT1敲除組細(xì)胞在放線菌素D的作用下，彗星率較各自未處理組顯著增高，但SIRT1敲除細(xì)胞在ActD處理后彗星率增高更為明顯，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖2)。

2.3 沉默SIRT1對DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白NBS1磷酸化表達(dá)水平的影響

圖 1 RT-PCR及Western blot檢測shRNA轉(zhuǎn)染后48 h SIRT1mRNA及蛋白表達(dá)水平變化Fig. 1 RT-PCR and Western blot analysis of SIRT1 expression after transfect of SIRT1 shRNA for 48 h

圖 2 沉默SIRT1對PANC1細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的影響Fig. 2 Effect of specific silencing of SIRT1 on cell DNA damage repair of PANC1 pancreatic cancer cell

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照細(xì)胞相比，ActD處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)磷酸化NBS1蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，而總蛋白水平在各組細(xì)胞中無顯著變化。而轉(zhuǎn)染針對SIRT1基因的shRNA后，shSIRT1-PANC1細(xì)胞磷酸化NBS1蛋白表達(dá)水平較對照細(xì)胞shSCR-PANC1顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖3)。

2.4 轉(zhuǎn)染shRNA對PANC1細(xì)胞放化療敏感性的影響

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默SIRT1后PANC1細(xì)胞對順鉑的藥物敏感性顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖4A)。同時(shí)，克隆存活實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)SIRT1亦顯著增加胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1對放射線照射的敏感性(P＜0.01，圖4B)

圖 3 Western blot檢測SIRT1沉默對磷酸化NBS1和γH2AX蛋白表達(dá)的影響Fig. 3 Western blot analysis of phosphorylation NBS1 and γH2AX after down-regulation of SIRT1

圖 4 抑制SIRT1基因表達(dá)對胰腺癌PANC1細(xì)胞放化療敏感性的影響Fig. 4 Specific silencing of SIRT1 on chemo-and radiosensitivity of PANC1 pancreatic cancer cell.

3 討 論

放射線或部分化療藥物造成細(xì)胞DNA損傷的一個(gè)最常見保護(hù)性反應(yīng)是G2/M期延長或停滯［9］。G2/M期具有細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的活性，負(fù)責(zé)監(jiān)督細(xì)胞對DNA損傷的修復(fù)。DNA損傷修復(fù)是恢復(fù)正常DNA序列結(jié)構(gòu)和維持遺傳信息相對穩(wěn)定有關(guān)的細(xì)胞反應(yīng)。DNA損傷修復(fù)基因可修復(fù)不同原因?qū)е碌腄NA損傷，從而保護(hù)遺傳信息的完整性［10］。

DNA損傷修復(fù)過程中，染色質(zhì)的重構(gòu)是非常重要的一部分，通過染色質(zhì)的重塑修復(fù)受損的DNA，保護(hù)細(xì)胞免受傷害［11］。既往的研究結(jié)果證實(shí)，SIRT家族成員之一的SIRT1在真核細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)中起了重要的作用［12］。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了前期發(fā)現(xiàn)，利用RNA干擾技術(shù)沉默胰腺癌細(xì)胞PANC1中SIRT1的表達(dá)能顯著抑制其DNA損傷修復(fù)反應(yīng)。同時(shí)，Western blot結(jié)果顯示，沉默SIRT1能顯著抑制DNA修復(fù)關(guān)鍵蛋白NBS1的磷酸化活化。NBS1是激活DNA損傷修復(fù)信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵分子，其在維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定和DNA的損傷修復(fù)過程中均具有重要作用［13］。因此我們認(rèn)為，SIRT1可通過促進(jìn)NBS1磷酸化活化，進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞DNA的損傷修復(fù)能力。

現(xiàn)有的多種臨床治療腫瘤的手段中，通過靶向腫瘤細(xì)胞DNA，促進(jìn)其斷裂是放療和部分化療藥物的主要作用原理［14］。胰腺癌細(xì)胞有著天然對放化療高度耐藥的生物學(xué)行為［15］，因此其對各種治療手段導(dǎo)致的DNA損傷可能存在極強(qiáng)的自身修復(fù)能力。已有文獻(xiàn)報(bào)道，SIRT1在胰腺癌細(xì)胞中呈顯著高表達(dá)，而且其表達(dá)和胰腺癌細(xì)胞的化療的耐藥性有一定關(guān)系［16］。本研究結(jié)果也證實(shí)，抑制SIRT1能部分恢復(fù)胰腺癌細(xì)胞對放療和化療的敏感性。提示，通過檢測SIRT1的表達(dá)水平不僅可以預(yù)測胰腺癌患者對放化療的療效反應(yīng)，而且還可以作為干預(yù)胰腺癌放化療抵抗的重要靶點(diǎn)。靶向SIRT1進(jìn)行干預(yù)并同時(shí)聯(lián)合放化療這一新的治療策略，有可能使對常規(guī)放化療不敏感的胰腺癌由不治之癥變成部分可治。

綜上所述，SIRT1可通過促進(jìn)NBS1磷酸化，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)反應(yīng)進(jìn)而促進(jìn)其對放化療抵抗。本研究為胰腺癌的治療提供了新的思路，也為逆轉(zhuǎn)局部進(jìn)展期或晚期胰腺癌的放化療抵抗提供了新的分子靶標(biāo)。

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Impact of SIRT1 silencing on DNA damage repair and chemoradiotherapy resistance in human pancreatic cancer

XU Jin, ZHU Wen-wei, QIN Yi, XU Wen-yan, JI Shun-rong, YU Xian-jun (Department of Pancreas and Hepatobiliary Surgery, Pancreas Cancer Institute, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China) Correspondence to: YU Xian-jun E-mail: yuxianjun88@hotmail.com

Background and purpose：SIRT1 is widely up-regulated in different cancers including pancreatic cancer (PC) and may be involved in the cellular malignant transformation. This study was designed to investigate the effects of down-regulated SIRT1 expression on the DNA damage repair capacity as well as chemoradiosensitivity of PC cells. Methods：DNA damage repair was analyzed by comet assay under the condition of SIRT1 suppression. Western blot was performed to investigate the expression of DNA repair associated proteins including, NBS1 and γH2AX. Clonogenic survival assay and MTT assay were used to detect the chemoradiosensitivity following SIRT1 silencing. Results：Knockdown of SIRT1 significantly impaired DNA damage repair capacity while increased the sensitivity of PANC1 cells to radiation and chemotherapy. Mechanically, down-regulation of SIRT1 inhibited NBS1 activation in the presence of DNA damage repair. Conclusion：Down-regulated SIRT1 expression inhibits the activation of NBS1 and thus is involved in DNA damage repair arrest and restoration of chemoradiosensitivity.

SIRT1; Pancreatic cancer; DNA damage repair; NBS1

R735.9

：A

：1007-3639(2013)02-0093-06

2012-12-10

2013-01-20）

虞先濬 E-mail:yuxianjun88@hotmail.com

DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2013.02.003