石其德，朱驪安，姜俊云，董惠鈞

(1.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東 臨沂 276006;2.聊城大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 聊城 252000)

奧利司他是一種強(qiáng)效和長效脂肪酶抑制劑，能抑制腸道內(nèi)脂肪酶活性，減少攝入脂肪的消化和吸收。作為一種新型減肥藥，它不會(huì)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，毒副作用也比較小[1]。目前國內(nèi)奧利司他原料藥有2種工業(yè)化生產(chǎn)方法，即半合成法和全化學(xué)合成法。半合成生產(chǎn)工藝[2-3]為經(jīng)微生物發(fā)酵獲得奧利司他前體物利普司他汀，初步分離精制獲得利普司他汀粗品，催化氫化利普司他汀轉(zhuǎn)化為奧利司他，最后經(jīng)有機(jī)溶劑結(jié)晶精制獲得奧利司他合格成品。本研究中以半合成法生產(chǎn)奧利司他為例，對(duì)生產(chǎn)工藝中的雜質(zhì)種類和來源進(jìn)行了分析，提出了對(duì)工藝雜質(zhì)和降解產(chǎn)物有效控制的策略和方法。由于奧利司他屬于新藥，2010年版《中國藥典》尚未收錄，因此本研究對(duì)于奧利司他生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制具有借鑒和指導(dǎo)意義。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型(紫外檢測(cè)器)高效液相色譜系統(tǒng)。奧利司他對(duì)照品為自制，純度大于99.6%;乙腈為色譜純，甲醇、庚烷、過氧乙酸、鹽酸和氫氧化鈉等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent C18柱(250 mm ×4.6 mm，2.5 μm);流動(dòng)相:乙腈 -水(80∶20);紫外檢測(cè)波長:195 nm;流速:1.2 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL。

2.2 工藝雜質(zhì)分析

原料藥的工藝雜質(zhì)主要是指反應(yīng)副產(chǎn)物、未反應(yīng)的原料或中間體及溶劑等。特別是對(duì)發(fā)酵原料藥而言，其工藝雜質(zhì)來源和種類更為復(fù)雜和多樣，對(duì)這類原料藥工藝雜質(zhì)的控制一直是項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。另外，原輔料引入的雜質(zhì)和反應(yīng)過程中接觸設(shè)備或容器引入的雜質(zhì)也是工藝雜質(zhì)的可能來源。

利普司他汀發(fā)酵引入的雜質(zhì):前體物利普司他汀發(fā)酵不可避免地會(huì)引入雜質(zhì)，給下游奧利司他的純化帶來困難。這些雜質(zhì)主要是毒三素鏈霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物，與利普司他汀的相對(duì)保留時(shí)間分別為 0.67，0.75，0.80，0.94，1.10，1.26，這些雜質(zhì)的性質(zhì)與利普司他汀很相似，在高效液相色譜圖上的保留時(shí)間也非常相近(見圖1)，單純利用層析或萃取方法很難去除。按照人用藥品注冊(cè)技術(shù)規(guī)范國際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)的質(zhì)量要求，未知雜質(zhì)應(yīng)控制在0.1%以下，故應(yīng)通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵調(diào)控來有目的地控制和降低這些雜質(zhì)的含量。再就是微生物代謝產(chǎn)生的水溶性和脂溶性色素，對(duì)于脂溶性色素可通過層析結(jié)合結(jié)晶的方法去除，只要下游純化工藝合理有效，這些色素雜質(zhì)不會(huì)對(duì)產(chǎn)品的最終質(zhì)量產(chǎn)生影響。

圖1 毒三素鏈霉菌發(fā)酵液中利普司他汀和主要雜質(zhì)色譜圖

氧化作用產(chǎn)生的雜質(zhì):奧利司他從分子式組成上看屬于酯類物質(zhì)，在接觸空氣或氧化性物質(zhì)條件下，容易發(fā)生氧化反應(yīng)。本研究中用含20%體積的3%過氧乙酸甲醇溶液溶解奧利司他，配制成1 g/L的質(zhì)量濃度，置振蕩器中處理60 min，模擬加速氧化過程，20 μL進(jìn)樣、分析。結(jié)果見圖2和表1。與標(biāo)準(zhǔn)品相比，多出5個(gè)雜質(zhì)峰，與主峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為 0.42，0.47，0.49，1.20，1.32，而且主峰面積明顯減少，表明奧利司他發(fā)生了顯著分解。其中前3個(gè)雜質(zhì)峰先于奧利司他出現(xiàn)，后2個(gè)雜質(zhì)在奧利司他之后出峰，因此在生產(chǎn)過程中除了縮短制備時(shí)間、防止接觸氧化物質(zhì)和充填氮?dú)鈦矸乐寡趸?，?duì)于前3個(gè)雜質(zhì)，利用結(jié)晶法能夠比較容易去除;而對(duì)于極性弱于奧利司他的后2個(gè)雜質(zhì)，則需要結(jié)合結(jié)晶和層析的方法才能去除得比較徹底。

圖2 不同處理?xiàng)l件下奧利司他高效液相色譜圖

表1 不同處理方法處理后的奧利司他原料雜質(zhì)分析(相對(duì)保留時(shí)間)

自然降解產(chǎn)生的雜質(zhì):用含有20%(V/V)水的甲醇溶液溶解奧利司他，配制成1 g/L的質(zhì)量濃度，置振蕩器中處理48 h，取20 μL進(jìn)樣，分析。結(jié)果見圖2和表1，表明在含水的醇溶液中，奧利司他會(huì)發(fā)生水解，特征性雜質(zhì)峰的相對(duì)保留時(shí)間為0.82，其他雜質(zhì)還有0.42，0.52，而在不含水的醇溶液中奧利司他不發(fā)生水解(數(shù)據(jù)未列)。故在奧利司他制備過程相對(duì)保留時(shí)間0.82的雜質(zhì)會(huì)成為主要雜質(zhì)，增加純化的難度。故應(yīng)盡量減少含水溶劑的使用，即使使用也應(yīng)減少對(duì)奧利司他的作用時(shí)間。對(duì)于相對(duì)保留時(shí)間為0.82的雜質(zhì)去除，最有效的方法是硅膠層析或利用中等極性有機(jī)溶劑進(jìn)行反溶劑層析結(jié)晶。

受熱分解產(chǎn)生的雜質(zhì):用純甲醇溶解奧利司他配制成1 g/L的質(zhì)量濃度，放置在60℃水浴中處理24 h，取20 μL進(jìn)樣、分析。由于在制備工藝中存在減壓濃縮等工序，奧利司他會(huì)受熱作用。結(jié)果見圖2和表1，顯示相對(duì)保留時(shí)間1.37的雜質(zhì)明顯增大，另外相對(duì)保留時(shí)間為0.82的雜質(zhì)也增大。因此要控制減壓濃度溫度不能過高，同時(shí)處理時(shí)間盡可能短，或使用高效的降膜濃縮設(shè)備以減少受熱時(shí)間。對(duì)于相對(duì)保留時(shí)間為1.37的雜質(zhì)，通過非極性溶劑結(jié)晶方法能夠去除。

遇酸性物質(zhì)產(chǎn)生的雜質(zhì):用含有20%2 mol/L鹽酸的甲醇溶液溶解奧利司他，配制成1 g/L的質(zhì)量濃度，置振蕩器中處理60 min，取20 μL進(jìn)樣，分析。在酸性環(huán)境中，奧利司他發(fā)生明顯分解，相對(duì)保留時(shí)間為0.82的雜質(zhì)峰顯著增大，而奧利司他主峰后的2個(gè)雜質(zhì)峰也發(fā)生酸解(圖2和表1)。故無論在制備過程還是成品保藏中，應(yīng)杜絕接觸酸性物質(zhì)。

遇堿性物質(zhì)產(chǎn)生的雜質(zhì):用含有20%2 mol/L氫氧化鈉的甲醇溶液溶解奧利司他，配制成1 g/L的質(zhì)量濃度，置振蕩器中處理60 min，取20 μL進(jìn)樣，分析。與其他處理?xiàng)l件相比，堿性環(huán)境對(duì)奧利司他的破壞分解作用最強(qiáng)。圖2顯示奧利司他完全分解消失，在相對(duì)保留時(shí)間0.58處出現(xiàn)1個(gè)明顯的雜質(zhì)峰。故奧利司他遇堿最不穩(wěn)定，應(yīng)在各個(gè)制備和保藏環(huán)節(jié)避免接觸堿性物質(zhì)。

包裝材料雜質(zhì)分析:在奧利司他的生產(chǎn)過程中，由于會(huì)使用能溶解聚乙烯等塑性材料的有機(jī)溶劑，如庚烷、丙酮和石油醚等，因此在與物料直接接觸的生產(chǎn)設(shè)備或器皿、密封材料和包裝材料的選擇上，要優(yōu)先選擇不銹鋼或耐有機(jī)溶劑腐蝕的材料。已有文獻(xiàn)報(bào)道了因奧利司他包裝材料的質(zhì)量問題而引入的雜質(zhì)[4]，對(duì)于此類雜質(zhì)的防范，只需嚴(yán)格避免使用或接觸塑性材料即可。本研究中選用不同的包裝材質(zhì)在恒溫、干燥條件下保藏奧利司他30 d，取樣利用高效液相色譜法分析奧利司他原料藥中的雜質(zhì)情況。結(jié)果(表2和圖3)表明，用聚乙烯、硅橡膠和乳橡膠等包裝材料，會(huì)在奧利司他原料藥中引入數(shù)量和種類不同的雜質(zhì)，而采用聚丙烯或聚酰胺類包裝材料則不會(huì)引入雜質(zhì)。

表2 不同包裝材料在奧利司他原料藥中引入雜質(zhì)的高效液相色譜鑒別

圖3 不同包裝材料貯存奧利司他的高效液相色譜圖

3 討論

奧利司他是一種新型減肥藥，進(jìn)口膠囊劑已在我國上市多年，但由于工藝復(fù)雜和質(zhì)量不穩(wěn)定，國內(nèi)仿制藥于2011年才獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)。奧利司他是經(jīng)過微生物發(fā)酵和化學(xué)轉(zhuǎn)化獲得的，步驟多，工藝控制嚴(yán)格，且由于原研廠商生產(chǎn)的奧利司他原料藥的雜質(zhì)控制水平達(dá)到0.1%以下，對(duì)國內(nèi)的仿制者來說是非常大的挑戰(zhàn)。目前，國內(nèi)領(lǐng)先的原料藥廠商海正藥業(yè)和聯(lián)邦制藥主要通過動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱技術(shù)制備單雜在0.1%以下的奧利司他原料藥[5-6]。本研究通過試驗(yàn)確定了奧利司他從生產(chǎn)到包裝過程中可能引入雜質(zhì)的種類和可能的途徑，為奧利司他質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了科學(xué)依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，采取源頭控制降低發(fā)酵工藝雜質(zhì)、重視中間流程控制雜質(zhì)變化及升級(jí)核心技術(shù)去除手性雜質(zhì)等措施，不采用制備色譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)單雜在0.1%以下的高品質(zhì)奧利司他原料藥。

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