趙永星 隗和明 盧君 張廣欽

心肌細胞內(nèi)的鈣調(diào)控(Calcium handling)對于維持心臟和心肌細胞的正常生理功能有著重要作用。鈣調(diào)控失常見諸于幾乎所有的先天和后天的人類心臟病變，如心臟衰竭，心肌肥厚等［1］。鈣成像(Calcium imaging)是目前最為有效的檢測細胞內(nèi)鈣調(diào)控的技術，鈣離子熒光指示劑(Fluorescence calcium indicators)如Fluo-4 AM可以隨 Ca2+離子的結(jié)合而改變其熒光特性。激光共聚焦顯微技術(Laser confocal microscopy)以其高分辨的優(yōu)勢，可以提供更好的細胞內(nèi)鈣離子濃度動態(tài)變化的圖像，包括鈣瞬變和鈣火花［2］。

在成年動物的心室細胞中，為了觀察細胞鈣釋放特征，我們常用刺激誘發(fā)心肌細胞的鈣釋放。然而，使用傳統(tǒng)的刺激器［3］(如YSD-4GA型生理實驗多用儀)誘發(fā)心肌細胞搏動時，需在培養(yǎng)皿兩端中放置正負兩電極于心肌細胞兩端(圖1)，但在操作時電極之間的距離不穩(wěn)定，影響細胞收縮的刺激閾電壓。我們實驗室采用多孔板內(nèi)置入板狀電極構(gòu)成場刺激的原理，利用C-Pace刺激器成功地誘發(fā)多個成年大鼠的心室肌細胞同步搏動，從而建立穩(wěn)定的測定細胞內(nèi)鈣離子動態(tài)變化的方法。

圖1 YSD-4GA型生理實驗多用儀

1 材料與方法

1.1 儀器和溶液的配制儀器 Ion C-Pace EP刺激器(Ion Optix corporation，USA)。玻璃底6孔板(MatTeK Corporation，USA)，激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss LSM-710，Germany)試劑:膠原酶Ⅱ(CollegaseⅡ)購自Worthington Biochemical公司(USA);HEPES，Glucose，EGTA，?；撬岷?L-谷氨酸等試劑均購自美國Sigma公司。無鈣臺式液(mmol/L):NaCl 137，KCl 5.4，MgCl2.6H2O 1，NaH2 PO4 0.33 葡萄糖10，HEPES 10，用NaOH調(diào)pH至7.40。KB液(mmol/L):KCl 40，KH2PO420，MgCl2.6H2O 3，L-谷氨酸50，?；撬?0，HEPES 10，KOH 80，葡萄糖10，EGTA0.5，用 KOH調(diào) pH至7.40。正常臺式液(mmol/L):無鈣臺式液中加1 mmol/L CaCl2，溶液均用純氧飽和。

1.2 急性心肌單細胞的分離 成年SD大鼠，雌雄不拘，體重200～300 g。由 SingHealth Experimental Medical Centre(SEMC，新加坡)提供。利用改進的 Langendoff灌流法［4］分離單個成年大鼠心室肌細胞。大鼠腹腔麻醉，迅速開胸取心臟，主動脈插管逆向灌流，先以無鈣臺式液清洗殘留的血液，再灌流含有0.3 mg/ml膠原酶Ⅱ，1 mg/ml牛血清白蛋白和1 mg/ml牛磺酸的無鈣臺式液繼續(xù)灌流約30 min后，將心臟組織放入KB液中剪碎吹打，細胞懸液用200目濾網(wǎng)過濾，分離的心肌細胞KB液中保存2 h后，經(jīng)臺氏液梯度復鈣至1 mmol/L。

1.3 刺激器的連接及使用C-Pace EP刺激器由三部分組成:8通道刺激器(圖2A)，導線和與多孔板匹配的固定板型電極板(圖2B)。該系統(tǒng)是具備諸多優(yōu)點:①它有8個通道，經(jīng)板上固定電極與玻璃六孔板(四孔板，八孔板皆可)連接(圖2C)，可以允許同時刺激8個多孔板。②輸出電壓的范圍達到正負40 V，頻率范圍在0.01到99 Hz之間，脈沖時間范圍在4 ms到24 ms，可以根據(jù)實驗要求設置所需參數(shù)。③支持數(shù)字輸入和輸出。④刺激輸出端有短路保護，能承受長時間的短路。⑤刺激器通過導線與電極板和玻璃板相連(圖2D)，可以允許培養(yǎng)室門關閉，有利于細胞培養(yǎng)，保持細胞處于良好狀態(tài)。本實驗所用刺激器的參數(shù)設置為:10 mV，1 Hz，2 Hz。

圖2 C-Pace EP刺激裝置

1.4 激光共聚焦掃描顯微鏡鈣成像 細胞在室溫下以6 μg/ml的Fluo-4［5］熒光探針染色約15 min，然后將細胞置于每孔含3 ml正常臺式液的6孔板中，為使細胞更好的貼壁，玻璃底部提前用Laminin(1 μg/cm2)處理半個小時。選擇適合的心肌細胞(細胞橫紋清晰呈現(xiàn)桿狀，表面干凈)進行實驗。將板型電極放入六孔板中并與刺激器連接。然后把六孔板置于Carl Zeiss LSM-710型激光共聚焦顯微鏡上，物鏡為40倍油鏡，數(shù)值孔徑為1.3 nA，激發(fā)光為功率25 mW的488 nm的氬激光，大于505 nm波長收集發(fā)射光，共掃描1000條線，每條線包含512個像素，掃描速度為每條線3 ms。圖像以線掃描方式(X-T)進行。實驗室溫度控制在20℃～25℃。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌細胞的分離通過對裝置的改良，以及適當?shù)卣莆盏南瘯r間和消化溫度，成功的分離出適合做激光共聚焦顯微鏡的單個大鼠心室心肌細胞。復鈣后細胞成活率70%左右，鏡下觀察，靜息狀態(tài)細胞呈桿狀、橫紋清晰、遮光性強、細胞無明顯自發(fā)性收縮(圖3)。后續(xù)實驗表明，該方法分離出的心肌細胞能夠滿足多種實驗的需求。

圖3 分離的單個心肌細胞

2.2 心肌細胞鈣瞬變的激光共聚焦線掃描在靜息狀態(tài)下心肌細胞很少收縮，但少數(shù)細胞有時會出現(xiàn)自發(fā)性收縮，產(chǎn)生不規(guī)則的鈣波(圖4A)。當使用刺激時，隨著電壓的增加，細胞開始出現(xiàn)收縮，隨頻率出現(xiàn)明顯的鈣瞬變。參數(shù)為1 Hz時，圖4B和4C分別是當頻率為1 Hz和2 Hz時心肌細胞隨頻率變化的鈣瞬變圖像。當加入咖啡因(10 mM)，鈣瞬變強度快速明顯增加，顯示鈣庫中的鈣釋放(圖4D)。我們可通過分析鈣瞬變的熒光強度測量鈣釋放的量。

圖4 鈣掃描原始圖

3 討論

心肌興奮－收縮耦聯(lián)是從心肌細胞電興奮到收縮的一個過程。在這個過程中 Ca2+不僅參與心肌電興奮活動，而且直接與肌絲蛋白結(jié)合引起心肌收縮［6］。在疾病狀態(tài)下，如心肌肥厚，心肌衰竭等，心肌的鈣釋放異常，心肌興奮－收縮耦聯(lián)發(fā)生障礙，導致心功能下降［7］。因此，我們通過對心肌細胞鈣釋放特征的研究，從而探討疾病的發(fā)生機制。在以往的心肌細胞鈣信號研究中，刺激電極往往都是根據(jù)實驗的需要通過自己加工制作，所用材料，電極直徑，電極之間的距離不同，使每次實驗時誘發(fā)鈣釋放的電壓，心肌收縮幅度有較大的差異，其結(jié)果的重復性帶來較大的誤差。C-Pace EP刺激器正在被廣泛地應用［8］，相比傳統(tǒng)刺激器，該刺激器輸出通道多，輸出電壓和脈沖時間的范圍大，輸出端有極好的短路保護，刺激電極是固化在面板上。其次，C-Pace EP刺激器操作方便，穩(wěn)定性高，不依賴正負電極導線，可固定裝置在Carl Zeiss LCM710等高端顯微鏡平臺，使每次分離的心肌細胞測定誤差較小。最后，基于C-Pace EP刺激器的Ca2+成像法可以在短時間內(nèi)完成多細胞，多實驗組以及不同藥物的鈣瞬變記錄。本次實驗中，我們應用C-Pace EP刺激器能夠記錄到較好的鈣瞬變圖像，并觀察在一個6孔板中測定的鈣瞬變的刺激參數(shù)等，其結(jié)果顯示較小的誤差。雖然此方法克服了每次實驗參數(shù)和結(jié)果出現(xiàn)的誤差，但是應用C-Pace EP刺激器進行鈣掃描也有不足之處，我們發(fā)現(xiàn)C-Pace EP刺激器的設計缺陷對鈣成像造成不便，因電極板在多孔板上面，加大了給藥的距離，給藥時容易引起細胞外液的波動，使細胞貼壁狀態(tài)不夠好，偶爾會造成焦距的飄移，從而干擾實驗的順利進行。

本實驗以激光共聚焦顯微鏡作為測量手段，配以新型的Ion C-Pace EP刺激器作為輔助工具，易于操作且穩(wěn)定，重復性高，能滿足獲得穩(wěn)定實驗結(jié)果的需要。本實驗方法的建立為各種動物心肌細胞內(nèi)鈣動態(tài)變化的測量提供了技術基礎。

［1］Kho C，Lee A，Hajjar RJ.Altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling-targetsfor heart failure therapy.Nat Rev Cardiol，2012，9(12):717-733.

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