周曉紅

研究表明，除HIV、HBV和HCV等病毒外，血液制品的細(xì)菌污染也是輸血相關(guān)的發(fā)病和死亡的重要因素，而血小板因其需要室溫保存，同時(shí)儲(chǔ)存時(shí)不斷搖動(dòng)，血小板中豐富的營養(yǎng)也利于細(xì)菌生長，一旦被污染，細(xì)菌就會(huì)很快在其中繁殖。使血小板細(xì)菌污染成為導(dǎo)致膿毒血癥輸血反應(yīng)最常見的原因。目前血小板制品細(xì)菌污染問題已引起各國的重視，國外的一些血液中心已經(jīng)將血小板制品的細(xì)菌污染檢測納入到常規(guī)檢測項(xiàng)目，主要應(yīng)用BacT/Alert全自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)儀檢測血小板的細(xì)菌污染情況［1］。但由于該方法檢測時(shí)間長、成本高、靈敏度低，對(duì)某些細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生漏檢等缺點(diǎn)，限制其在血液樣本大規(guī)模篩查中得應(yīng)用。

針對(duì)革蘭氏陰性菌脂多糖檢測，由于其快速、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)，使得血小板制品細(xì)菌污染的快速檢測成為可能。目前該檢測方法有一定的局限性，只能檢測革蘭氏陰性菌脂多糖，不能區(qū)分細(xì)菌種屬，而革蘭氏陽性菌肽聚糖的檢測需MB-80V型檢測系統(tǒng)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 100份血小板樣本均來源于本站2011年11月至2012年11月無償獻(xiàn)血者捐獻(xiàn)的單采血小板，樣本經(jīng)BacT/Alert全自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)儀檢測，確定為陰性。陰性組:隨機(jī)抽取68份樣本作為陰性對(duì)照;陽性組:隨機(jī)抽取32份樣本，接入濃度為10CFU/ml的菌懸液作為陽性樣本;將上述100份樣本用MB-80E細(xì)菌內(nèi)毒素檢測系統(tǒng)檢測。

1.2 試劑與儀器 革蘭陰性菌脂多糖檢測試劑盒(北京金山川科技發(fā)展有限公司)、MB-80E微生物快速動(dòng)態(tài)檢測系統(tǒng);BacT/AlertBPA需氧培養(yǎng)瓶(美國梅里埃公司)、BacT/AlertBPN厭氧培養(yǎng)瓶(美國梅里埃公司)、BacT/Alert全自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)儀。

1.3 方法

1.3.1 在無菌條件下取血小板0.1 ml，加入裝有0.9 ml樣品處理液中，混勻后70℃保溫10 min，取出后立刻放入冰水浴中，即為待測樣品。取待測血漿0.2 ml直接加入酶反應(yīng)主劑中，溶解后使用微量加樣器轉(zhuǎn)移至10×75 mm標(biāo)準(zhǔn)玻璃反應(yīng)管中，插入MB-80E微生物快速動(dòng)態(tài)檢測系統(tǒng)中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)計(jì)算出待測樣品中革蘭陰性菌脂多糖含量。

1.3.2 單采血小板制品采集24 h候取樣，充分混勻后擠壓到轉(zhuǎn)移袋約5～10 ml，封閉熱合。在無菌條件下用一次性無菌注射器抽取轉(zhuǎn)移袋中血小板制品，接種到1瓶需氧培養(yǎng)瓶，1瓶厭氧培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)瓶放入全自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)儀中，每天觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

見表1。

表1

3 討論

68份血小板陰性標(biāo)本檢測結(jié)果細(xì)菌內(nèi)毒素含量在1～4pg/ml之間，32份血小板陽性標(biāo)本細(xì)菌內(nèi)毒素含量在20.0～50.0pg/ml之間，并且BacT/Alert全自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)儀32份血小板陽性標(biāo)本菌在24 h內(nèi)出現(xiàn)陽性結(jié)果。細(xì)菌內(nèi)毒素檢測10 pg/ml以下結(jié)果為正常，20 pg/ml以上為革蘭陰性菌感染有臨床意義。

由于缺少一種簡便、靈敏、特異、經(jīng)濟(jì)的檢測體系，我國大部分采供血機(jī)構(gòu)未將血液制品的細(xì)菌污染檢測納入常規(guī)檢測項(xiàng)目。另外在細(xì)菌污染研究中普遍采用規(guī)定時(shí)限內(nèi)初始細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果陰性即可發(fā)放的原則，因此，存在超過時(shí)限外出現(xiàn)陽性結(jié)果而血小板已經(jīng)發(fā)放并輸注的可能性。血小板制品細(xì)菌污染率和臨床輸血反應(yīng)率的差異提示，一方面，低水平的細(xì)菌污染不能引起臨床表現(xiàn);另一方面，由于大多數(shù)血小板制品使用給腫瘤、血液病和骨髓移植等免疫功能抑制的患者，特別是兒童患者，這些患者疾病的嚴(yán)重性和使用血小板制品時(shí)機(jī)選擇的不同，使其表現(xiàn)的膿毒血癥，甚至是膿毒性休克和死亡等臨床事件常常未能和輸入細(xì)菌污染的血小板制品關(guān)聯(lián)。使用MB-80E細(xì)菌內(nèi)毒素檢測系統(tǒng)檢測血小板制品，該法靈敏度高、特異性好，與BacT/Alert全自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)儀相比，耗時(shí)少，檢測反應(yīng)時(shí)間為3600 s，且成本低。通過對(duì)100份單采血小板標(biāo)本用MB-80E微生物快速動(dòng)態(tài)檢測系統(tǒng)和BacT/Alert全自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)儀同時(shí)檢測，結(jié)果一致，表明MB-80E微生物快速動(dòng)態(tài)檢測系統(tǒng)可用于血液制品細(xì)菌污染的常規(guī)檢測。特別是BacT/Alert全自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)儀，系統(tǒng)有效檢測細(xì)菌生長的靈敏度為1～10CFUs/mL，在抽樣時(shí)，由于血袋內(nèi)細(xì)菌濃度過低，造成或抽樣中活菌極少，或抽樣中沒有細(xì)菌。而產(chǎn)生陰性的培養(yǎng)結(jié)果［1］。而革蘭陰性菌脂多糖檢測原理是革蘭氏陰性菌脂多糖激活酶反應(yīng)主劑中得相應(yīng)因子后形成凝固蛋白，根據(jù)其引起的濁度變化對(duì)革蘭氏陰性菌脂多糖濃度進(jìn)行定量。

［1］Brecher ME，Hay SN Bacterial contamination of blood components.Clin Miccrobiol，18(1).